一、生化實驗

1、用已培養的營養瓊脂斜面上生長的菌苔，進行生化實驗，即β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、水楊苷分解和七葉苷分解試驗。

①β-半乳糖苷酶試驗

由于某些志賀氏菌可産生-半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚-半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰硝基酚，使培養基由無色變為黃色，以此可鑒定部分志賀氏菌，由實驗可得，除了宋内氏菌和痢疾志賀氏菌1型，鮑氏志賀氏菌13型的β-半乳糖苷酶為陽性以外，其餘生化試驗志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖1。

該痢疾志賀氏菌菌株編号為CMCC51252，不為痢疾志賀氏菌1型 圖1

②尿素試驗

某些細菌能産生尿素酶，将尿素分解、産生2個分子的氨，使培養基變為堿性，酚紅呈粉紅色。由于志賀氏菌不能産生尿素酶，因此志賀氏菌屬的培養物皆為陰性，以此來區分志賀氏菌屬與其他能産生尿素酶的細菌（如，普通變形杆菌）。如圖2。

圖2

③賴氨酸脫羧酶試驗

具有氨基酸脫羧酶的細菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→屍胺)和二氧化碳，使培養基變堿，使指示劑顯示出來。由于細菌發酵葡萄糖産酸，在培養初期培養基和對照培養基呈黃色，繼續培養時，若氨基酸經脫羧或水解産生胺類則培養基變堿，呈紫色或紫紅色，即為陽性反應；如至培養末期培養基如同對照管一如至培養末期培養基如同對照管一樣均呈黃色，則判為陰性反應。由于志賀氏菌屬的細菌不具備氨基酸脫羧酶，因此志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖3。

圖3

④鳥氨酸脫羧酶試驗

具有賴氨酸脫羧酶的細菌，使鳥氨酸脫去羧基，生成腐胺，從而使培養基變堿性并通過指示劑變色來觀察。由于細菌發酵葡萄糖産酸，在培養初期培養基和對照培養基呈黃色，繼續培養時，若氨基酸經脫羧或水解産生胺類則培養基變堿，呈紫色或紫紅色，即為陽性反應；如至培養末期培養基如同對照管一樣均呈黃色，則判為陰性反應。在志賀氏菌的檢驗中宋内氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌13型的鳥氨酸為陽性，其餘志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖4。

圖4

⑤水楊苷分解試驗

若細菌可将水楊苷分解為成葡萄糖和水楊醇，則使溶液pH下降，指示劑顔色變黃；若不能發酵水楊苷，則溶液顔色不變。在志賀菌屬的檢驗中，志賀菌屬的培養物皆為陰性。如圖5。

圖5

⑥七葉苷分解

若細菌可将七葉苷分解為葡萄糖與七葉素，七葉素與培養基中的二價鐵離子反應，生成黑色的化合物，使培養基變黑(例如：糞腸球菌)。在志賀菌屬的檢驗中，七葉苷分解實驗志賀氏菌屬的培養物均為陰性結果。如圖6。

圖6

2、由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似，必要時還需加做靛基質、甘露醇、棉子糖、甘油試驗。

①靛基質試驗

福氏志賀氏菌型細菌可分解色氨酸形成吲哚（靛基質）。吲哚和二甲基苯甲醛反應生成玫瑰紅色吲哚環，以大腸埃希氏菌為例，大腸埃希氏菌在24小時時即可呈現陽性反應，而福氏志賀氏菌則需要48小時才出現陽性結果，因此福氏志賀氏菌判定為遲緩陽性。如圖7。

該實驗結果為24小時時的實驗結果 圖7

②甘露醇試驗

若細菌能發酵甘露醇，則産酸使溶液pH下降，指示劑顔色變黃；若不能發酵甘露醇，則溶液顔色不變。在志賀菌屬的檢驗中，福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌和宋内志賀氏菌為甘露醇陽性反應，痢疾志賀氏菌為陰性反應，其中福氏4型和6型為常見甘露醇陰性變種。如圖8。

該福氏志賀氏菌不為福氏4型和6型 圖8

③棉子糖試驗

若細菌能發酵棉子糖，則産酸使溶液pH下降，指示劑顔色變黃；若不能發酵棉子糖，則溶液顔色不變。在志賀菌屬的檢驗中，福氏志賀氏菌和宋内志賀氏菌為棉子糖陽性反應，痢疾志賀氏菌和鮑氏志賀氏菌為陰性反應。如圖9。

圖9

④甘油試驗

若細菌能利用甘油，則産酸使溶液pH下降，指示劑顔色變黃；若不能利用甘油，則溶液顔色不變。在志賀菌屬的檢驗中，痢疾志賀氏菌與鮑氏志賀氏菌為遲緩陽性反應，福氏志賀氏菌為陰性反應，宋内志賀氏菌實試驗結果無法确認，即有陽性反應也有陰性反應，以标準菌株宋内志賀氏菌CNCC（B）51592為例，其生化反應為陽性反應，溶液顔色為黃色。培養18小時時實驗結果圖10所示，其中痢疾志賀氏菌為遲緩陽性在18小時時不能呈現完全陽性現象。

圖10

3、此外，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性杆菌。生化反應不符合的菌株， 即使能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬。

在志賀氏菌檢驗的生化實驗中結果總結如表2所示：

二、附加生化實驗

由于某些不活潑的大腸埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 堿性-異型）菌的部分生化特征與志賀氏菌相似，并能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集；因此前面生化實驗符合志賀氏菌屬生化特性的培養物還需另加葡萄糖铵、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36℃培養24h～48h)。

①葡萄糖铵試驗

若細菌可利用铵鹽作為唯一氮源，可在此培養基中生長良好，并分解葡萄糖産酸，使培養基變黃，呈陽性反應；不能利用铵鹽作為唯一氮源的細菌在此培養基中不生長，培養基顔色不變，即為陰性反應。在葡萄糖铵的試驗中，志賀菌屬的培養物均為陰性結果。如圖11。

圖11

②西蒙氏檸檬酸鹽試驗

某些細菌可利用铵鹽作為唯一氮源，并同時利用檸檬酸鹽為唯一碳源以提供能量，進行生長繁殖。檸檬酸鹽被分解，産生碳酸鹽和碳酸氫鹽，而铵鹽被分解産生氨，故培養基變堿性，通過指示劑變色反應，得以鑒别。在西蒙氏檸檬酸鹽的試驗中，志賀菌屬的培養物均為陰性。如圖12。

圖12

③粘液酸鹽試驗試驗

若細菌能夠利用粘液酸分解産酸，使指示劑變黃色，反之，培養基不變色。在粘液酸鹽試驗中，若粘液酸鹽測試肉湯實驗結果為培養基變黃色，粘液酸鹽質控肉湯（對照）培養基不變色，則判定該菌的實驗結果為陽性反應。反之，為陰性反應。如圖13。

圖13

在志賀氏菌檢驗中附加生化實驗結果總結如表3所示：

三、補充說明

在進行志賀氏菌的生化鑒定時，也可使用志賀氏菌生化鑒定條對其生化反應進行判斷，志賀菌生化鑒定條中包含了所有志賀菌生化鑒定所需要的培養基，方便快捷高效。如圖14所示，為宋内志賀氏菌18小時時的生化實驗結果（“ ”表示實驗結果為陽性，“-”表示實驗結果為陰性）：

圖14

四、血清學鑒定

1、抗原的準備

志賀氏菌屬沒有動力，所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體（O）抗原。菌體O抗原又可分為型和群的特異性抗原。一般采用 1.2%～1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原。

注意事項：①一些志賀氏菌如果因為K抗原的存在而不出現凝集反應時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水做成濃菌液，100℃煮沸15min～60min去除K抗原後再檢查。②D群志賀氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，與其他志賀氏菌群抗原不存在交叉反應。與腸杆菌科不同，宋内氏志賀氏菌粗糙型菌株不一定會自凝。宋内氏志賀氏菌沒有K抗原。

2、凝集反應

在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區域，挑取一環待測菌，各放1/2環于玻片上的每一區域上部，在其中一個區域下部加1滴抗血清，在另一區域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環或針分别将兩個區域内的菌落研成乳狀液。将玻片傾斜搖動混合1 min，并對着黑色背景進行觀察， 如果抗血清中出現凝結成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒有發生自凝現象，那麼凝集反應為陽性。如果生理鹽水中出現凝集，視作為自凝。這時，應挑取同一培養基上的其他菌落繼續進行試驗。如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征，而其血清學試驗為陰性的話，則按注1進行試驗。

福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原鑒别見表 4。

五、結果報告

綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果，報告樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。

注：本文依據《GB 4789.5-2012食品安全國家标準 食品微生物檢驗 志賀氏菌檢驗》

附：食品中志賀氏菌檢驗簡單介紹（上） 點擊查看

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