一、實驗目的

ü 了解層析技術的一般原理

ü 掌握紙層析的方法和原理，學會分析未知樣品的氨基酸成分

二、實驗原理

Ø 層析法亦稱色譜法，是利用混合物中各組分的物理、化學及生物學特性的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相中，即固定相和流動相，當流動相流過加有樣品的固定相時，各組分所受固定相的阻滞作用和受流動相的推動作用的影響各不相同，從而使各組分以不同速度移動而達到分離的目的

Ø 固定相：是由層析基質組成的，可以是固體物質（如吸附劑、凝膠、離子交換劑等），也可以是液體物質（如固定在纖維素或矽膠上的溶液），這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附、溶解、交換等作用

Ø 流動相：是在層析過程中，推動固定相上待分離的物質向一定方向移動的液體、氣體或超臨界體。柱層析中一般稱為洗脫液，薄層層析時稱為展層劑

Ø 分配系數：是指在一定的條件下，某一組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比例，常用K來表示，它是層析中分離純化物質的重要依據

Ø 遷移率：是指在一定條件下，某一組分在相同的時間内，在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值，常用Rf來表示

分配系數或遷移率的差異程度是決定幾種物質采用層析方法能否分離的先決條件，差異越大，分離效果越理想

Ø 層析根據不同的标準可以分為多種類型：如按固定相基質的形式不同可分為紙層析、薄層層析和柱層析；按流動相的形式不同可分為液相層析、氣相層析和超臨界層析；按分離的原理不同可分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析等

Ø 紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上的羟基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。有機相流經固定相支持物時，與固定相之間連續抽提，使物質在兩相間不斷分配而得到分離。溶質在濾紙上的移動速度用Rf值表示：

在一定條件下，某種物質的Rf值是常數。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統、層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關

v 氨基酸顯色反應——茚三酮反應原理：

所有的α-氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反應産生黃色物質

該反應分為兩步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮結合另一分子水合茚三酮和氨縮合生成有色物質

三、實驗器材

大試管及塞子，大頭針，三角薄層噴瓶，毛細管，吹風機，層析濾紙（新華一号），分液漏鬥

四、實驗材料與試劑

擴展劑：4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物

氨基酸混合液：0.5%的賴氨酸、脯氨酸、亮氨酸的混合液（各組份濃度均為0.5%）

顯色劑：0.1%水合茚三銅正丁醇溶液

五、實驗操作

Ø 取層析濾紙（20×2cm）一條，在紙的一端距邊緣3cm處用鉛筆劃一直線，取其中點作為原點。在大試管中加入适當的擴展劑，使擴展劑的液面處于懸挂在橡皮塞上的層析濾紙的原點到底端的中間

Ø 點樣：用毛細管将氨基酸混合液點在原點上，用吹風機吹幹，幹後再點一次。每次在紙上擴散的直徑最大不超過3mm

Ø 擴展：将點好樣的層析濾紙懸挂于橡皮塞的鈎子上，點樣端的底邊浸入擴展劑約1.5cm。保持大試管的垂直，待溶劑上升15～20cm時取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界限，用吹風機熱風吹幹

Ø 顯色：用三角薄層噴瓶将0.1％茚三酮正丁醇溶液均勻地噴在風幹的層析濾紙條上，用熱風吹幹即可顯出各層析斑點

Ø 計算各種氨基酸的Rf值

六、注意事項

Ø 為了防止濾紙被手上的汗液污染，應盡量在操作時帶手套

Ø 重複點樣時可用吹風機的冷風吹幹樣品，噴了茚三酮後的顯色則要用熱風吹幹濾紙

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