摘要：探讨丁酸梭菌（CLostrdium butyricum）B1株對5種常見動物緻病菌的體外拮抗作用。将丁酸梭菌分别與豬大腸杆菌（Escherichia col）K88、K99/O139株和豬腸炎沙門氏菌（Samonella enteritidis）O4HI株、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）混合接種于GAM培養基進行厭氧培養，并與緻病菌菌K88、K99、O139株和豬腸炎沙門氏菌O4Hi株、金黃色葡萄球菌均有顯著抑制作用。

仔豬腹瀉一直是養豬生産的一大難題。并由此給豬業帶來了巨大的損失。由于初生仔豬腸道微生物菌群處于形成階段，若在飼料中添加微生物制劑，可以利用益生菌的占位效應和固本扶正的功效來調節菌群平衡，發揮生物的拮抗作用以防治仔豬腹瀉，這種方法比使用抗生素和化學藥物有更好的經濟效益和環保效益。丁酸梭菌即酪酸菌，是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢杆菌，是人和動物體内正常的有益菌群。丁酸梭菌作為人用整腸藥物在日本已經有幾十年的使用曆史，應用效果十分顯著，而把它作為動物微生态制劑的研究才剛剛起步。我們用實驗室保存的丁酸梭菌B1株分别與5株豬常見緻病菌共培養，通過菌落計數，證明了丁酸梭菌對這些緻病菌的生物拮抗作用，為丁酸梭菌應用于豬飼料添加劑提供了一定的理論依據。

一、材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

丁酸梭菌 B1株，豬大腸杆菌K88、O139株，豬腸炎沙門氏菌O4HI株，金黃色葡萄球菌。以上均由華中農業大學農業微生物國家重點實驗室提供。

1.12 培養基

梭菌增值培養基（RCM培養基）：酵母浸膏3g牛肉浸膏10g氯化鈉5g三水合乙酸鈉3g半胱氨酸鹽酸鹽0.5g0.5%美藍0.2ml、蒸餾水1000ml；調節ph值為7.1±0.1,115℃、20min滅菌備用。GAM液體培養基（日本制藥株式會社，LB固體培養基。

1.2 方法

1.21 菌種活化

丁酸梭菌活化：凍幹管保藏菌株接種于裝有RCM培養基的PA瓶中，置80℃水浴10min後取0.1ml轉接9.9mlGAM液體培養基試管，厭氧靜止培養16h。緻病菌活化：将豬大腸杆菌K88株、K99株、O139株和豬腸炎沙門氏菌O4HI株、金黃色葡萄球菌凍幹管分别轉接LB斜面，置37℃培養48h後，取1環菌種接種于9.9mlGAM液體培養基試管，厭氧靜止培養16h。

1.22 活菌計數方法

緻病菌采用稀釋平闆計數法：将待測菌液搖勻，10倍連續稀釋，選取适當的稀釋度菌懸液0.1ml分貝滴加在3個LB培養基平闆上，置37℃培養48h後，計算其菌數，取平均值。由于丁酸梭菌是嚴格厭氧菌，在有氧情況下無法長出，計數結果為緻病菌菌數。

1.23 丁酸梭菌生長曲線、ph曲線測定

取25隻裝有9.9mlGAM液體培養基試管，将活化好的丁酸梭菌菌液稀釋到10萬CFU ml，取0.1ml接種到試管中，置37℃靜止培養，分别在0、4、8、12、16、20、24、36、48h取出1支混勻，測活菌數和ph值、丁酸梭菌和緻病菌混合培養：取10隻裝有9.8mlGAM液體培養基試管，将活化好的丁酸梭菌和緻病菌菌液均稀釋到10萬 CFU ml，各取0.1ml接種到試管中，置厭氧罐37℃恒溫靜止培養。分别在0、4、8、12、16、20、24、36、48h取出1支混勻，測活菌數和ph值，并與單獨培養的進行對照。

二、結果與分析

2.1 丁酸梭菌B1株的生長曲線和ph曲線

丁酸梭菌B1株在GAM培養基中生長良好，生長曲線和ph曲線見圖1.由圖1可知，菌株B1在培養基中3-4h進入對數生長期，菌數指數上升，代謝産生酸性物質，使培養基ph值也随之急速下降，對數生長長期維持約8h後進入穩定期，此後菌數不再增加，ph值穩定在46-4.7，而後在約24h時由于形成芽孢，ph值略有上升。見圖1.

2.2 對大腸杆菌K88株的拮抗作用

兩種菌混合培養時，由第24h開始，大腸杆菌K88的株數顯著低于單獨培養，到48h時，菌數差異達到兩個數量級以上，說明丁酸梭菌對大腸杆菌K88株有顯著抑制作用。混合培養的ph值降低速度快于單獨培養、結果見圖2.

2.3 對大腸杆菌K99株的拮抗作用

兩種菌混合培養時，由第24h開始，大腸杆菌K99株菌數顯著低于單獨培養，到48h時，菌數差異達到兩個數量級以上，說明丁酸梭菌對大腸杆菌K99株有顯著抑制作用。結果見圖3.

2.4 對大腸杆菌O139株的拮抗作用

兩種菌混合培養時，大腸杆菌O139株菌數一直顯著低于單獨培養，特别是培養後期，菌數差異擴大到約兩個數量級，說明丁酸梭菌對大腸杆菌O139株有顯著的抑制作用。結果見圖4.

2.5 對沙門氏菌O4Hi株的拮抗作用

兩種菌混合培養時，第12h後，沙門氏菌菌數顯著低于單獨培養到48h時，菌數差異達到約兩個數量級，說明丁酸梭菌對沙門氏菌O4Hi株有顯著抑制作用。結果見圖5。

2.6 對金黃色葡萄球菌的拮抗作用

兩種菌混合培養時，第4h開始，金黃色葡萄球菌菌數即顯著低于單獨培養，到48h時，菌數差異達到約5個數量級，說明丁酸梭菌對金黃色葡萄球菌有非常強烈的抑制作用。由于金黃色葡萄球菌代謝不産酸，丁酸梭菌發酵産酸使混合培養ph值顯著低于單獨培養。結果見圖6.

三、讨論

國内關于丁酸梭菌對人腸道緻病菌的拮抗作用的研究較多，而對動物腸道緻病菌的拮抗方面研究較少。有人研究發現，丁酸梭菌LCL166株與大腸菌O157株、痢疾杆菌F2a株、傷寒杆菌共培養24h，可降低緻病菌數1-2個數量級。有人研究發現，丁酸梭菌LCL166株與嬰兒雙歧杆菌及霍亂弧菌混合培養24h時，霍亂弧菌數與單獨培養相比，緻病菌菌數減少4個數量級以上。在對動物緻病菌拮抗方面，研究發現，丁酸梭菌RH2與豬大腸杆菌C83902，雞大腸杆菌C83851和雞白痢沙門氏菌Sg9以菌數比1:1共培養48h時，緻病菌數與對照相比，減少6個數量級，且從共培養的第6h開始菌數差異就逐漸擴大。對于丁酸梭菌抑制緻病菌的原因，大多數的研究者認為是由于丁酸梭菌生長速度快，在代謝過程中産生大量丁酸、醋酸和乳酸等有機酸，加速降低了培養基的ph值，不利于緻病菌的生長所緻。

我們研究發現，丁酸梭菌B1株對豬大腸杆菌K88、K99、O139株和豬腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的拮抗作用較強，共培養48h後緻病菌菌數比對照降低兩個數量級以上；同時還發現丁酸梭菌B1株隻對金黃色葡萄球菌全程具有較強的抑制效果，而對上述其他緻病菌0-24h的抑制效果不明顯，24-48h抑制效果顯著。為了驗證是否酸抑制在丁酸梭菌抑制緻病菌中起到主要作用，我們做試驗的時候曾取丁酸梭菌B1株的24h發酵液對上述緻病菌進行杯碟法抑菌試驗，結果表明，發酵液對緻病菌無明顯抑制作用，與研究丁酸梭菌對大腸杆菌SW體外抑制作用結果一緻。

上述結果表明：

1、丁酸梭菌對緻病菌的體外拮抗作用具有菌株特異性，不同的丁酸梭菌菌株對不同來源的緻病菌菌株的抑制作用差異較大。

2、丁酸梭菌發酵産生的短鍊脂肪酸在體外并不是抑制許多常見腸道緻病菌生長的主要因素，尤其是對于那些發酵産酸較強的大腸杆菌菌株而言

3、丁酸梭菌B1株可能還産生某種未知的抑菌因子，這種因子在穩定期的後期開始生成，并很快起到強烈的抑制有害菌的作用，我們認為可能與丁酸梭菌形成芽孢過程相關聯。

由于耐藥性問題，抗生素在飼料中應用受到了嚴格的限制，因而動物微生态制劑被認為是取代抗生素最具潛力的發展方向。丁酸梭菌由于内生芽孢，對逆境的抗性較強，同時又具有強烈的調節腸道菌群平衡的益生作用，在實際應用方面具有獨特的優勢，本研究表明，丁酸梭菌B1株在體外對引起仔豬腹瀉的常見腸道緻病菌--豬大腸杆菌K88、K99、O139株和豬腸炎沙門氏菌以及有害菌金黃色葡萄球菌的拮抗作用較強，作為飼料添加劑将具有廣闊的開發應用前景。

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