本文轉載自“丁香學術”公衆号。

據最新研究數據表明，人類肢體缺失的發生率預計将在未來30年裡大幅增加，每年約可影響 360萬人，如糖尿病患者、退伍軍人、創傷幸存者和周圍動脈疾病患者等。盡管發育和再生醫學領域已經取得了非常大的進展，但讓整個複雜器官成功再生這一目标仍然難以實現。目前，臨床醫生仍然缺乏有效的手段來促進組織的恢複或逆轉組織損失。

包括蝾螈、海星、螃蟹和蜥蜴在内的許多生物至少有部分肢體可以完全再生，扁蟲甚至可以被切成碎片，每一塊都可以重建為一個完整的有機體。人類的肝髒在損失50%後，具有驚人的、幾乎像扁蟲一樣的再生能力，幾乎可以恢複到原來的大小，但通過自然再生來恢複動物肢體功能的可能性仍然遙不可及。

2022年1月26日，來自美國塔夫茨大學等單位的科學家們在Science Advances發表了題為“Acute multidrug delivery via a wearable bioreactor facilitates long-term limb regeneration and functional recovery in adult Xenopus laevis”的文章，他們的研究發現不可再生的成年非洲爪蟾可以被一個短暫的生物反應器誘導到一個持續的再生狀态，使其潛在的再生能力被恢複，以再生和重塑失去的肢體。

再生的組織由皮膚、骨骼、脈管系統和神經組成，其複雜性和感覺運動能力遠遠超過未經治療的動物。此外，這種誘導方法不需要基因治療或幹細胞植入，同時還會産生分子、細胞和組織水平的變化，從而恢複肢體形态和感覺運動功能，這使得我們離再生醫學的目标更近了一步。

圖1. 研究成果（圖源：Science Advances）

五種藥物聯合方案可誘導截肢後骨再生

首先，研究人員将成年非洲爪蟾的後肢進行截肢，并安裝了被稱為BioDome的絲水凝膠裝置，該裝置包含單獨的絲水凝膠（BD）或五種促再生化合物（BDNF、1,4-DPCA、RD5、GH 和 RA）的水凝膠，後者統稱為MDT（Multidrug Treatment, 多藥物治療）。對照組動物被截肢并返回生長室而不進行治療（Not treatment, ND）。24小時後，設備被移除，動物在沒有進一步幹預的情況下持續長達18個月，研究人員定期評估後肢的再生情況。

在18個月的再生周期中，所有組别的再生軟組織長度都有所增加，但與其他組相比，多藥物治療的動物顯示出更大、更複雜的軟組織生長。這種軟組織生長的顯著增加最早于截肢後2周被觀察到，并且這種優勢一直持續到最後。這些數據表明，在截肢部位局部應用MDT可以誘導更大、更持久的再生反應。

圖2. 成年非洲爪蟾的後肢截肢，安裝絲水凝膠後後肢再生情況（圖源：Science Advances）

多藥物治療增加了截肢後的骨生長和骨重塑

為了表征再生的内部結構，他們分析了骨骼的生長及其模式。

三維CT掃描結果表明，與不進行治療組相比，多藥物治療組的截肢平面骨生長明顯增加。他們進一步分析了骨體積和骨小梁密度等解剖特征，以确定新生骨的複雜性。與其他組相比，MDT治療的動物顯示出更大的骨體積和小梁密度。同時，與其他組别相比，MDT組的骨長度早在截肢後4個月時就開始增加，大約在8個月時出現明顯的生長彎曲。這些觀察結果共同表明，MDT治療僅在創面放置24小時，就能誘導顯著的骨再生和骨重塑。

圖3. 骨骼生長及其模式（圖源：Science Advances）

轉錄組特征分析揭示發育通路的調控

為了深入了解MDT治療的作用機制，他們在不同時間點對MDT動物與ND動物的早期組織取樣，并進行了轉錄組分析。分析結果顯示，與截肢後7天的組織相比，11個小時的組織中的基因表達譜已經發生了顯著的變化。利用MDT和ND的顯著差異基因，他們富集出了顯著上調和顯著下調的信号通路。

圖4. 轉錄組分析（圖源：Science Advances）

進一步的基因集富集分析結果顯示，組織中前15個高度上調信号通路與神經調節、炎症信号傳導和細胞形态發生有關。對神經特異性激活相關基因組的進一步研究表明，腦特異性激酶、神經肽的表達、多巴胺受體和神經球蛋白在截肢後11小時達到峰值，然後在24小時和7天後下降。

有趣的是，他們還觀察到Wnt7a，一個參與胚胎前後軸發育的基因，在11小時後上調，在7天時進一步上調；關鍵的促再生炎症基因，如TGFB、PTGS2、IL1B和FOXP2分别在11和24小時高表達，但在7天後消失。

圖5. 基因集富集分析（圖源：Science Advances）

周圍神經再生和運動功能的恢複

再生醫學最終的目的是促進功能恢複，而不僅僅是解剖層面的恢複。因此，研究人員通過評估治療後18個月動物的運動反應來研究功能的再生。為了确定神經組織的存在，他們進行了免疫組化，用以評估周圍神經再生。

與ND或BD組相比，MDT組的神經束數量顯著增加，說明MDT治療促進了神經束的再生和神經支配。此外，MDT組的動物不僅有更多的神經束，而且這些動物的神經束直徑也比ND組大得多。

為了評估18個月後動物的功能是否恢複，他們進行了感覺運動評估。他們觀察到所有經MDT治療的動物後肢顯示出與正常動物相似的刺激-反應模式。這表明，與損傷前正常功能相比，他們的神經和神經肌肉已經得到了顯著的恢複；而未經處理的對照組動物沒有顯示出任何反應，表明功能嚴重喪失。這表明生物反應器裝置對周圍神經提供了有效的支持，并随着時間的推移促進了組織的神經再生，并且該裝置與MDT聯合進一步促進了再生。

圖6. 感覺運動評估（圖源：Science Advances）

結語

綜上所述，研究人員通過将截肢後的傷口包裹在生物反應器BioDome中，觸發了非洲爪蟾的再生過程。BioDome含有一種絲蛋白凝膠，内含五種混合藥物，每種藥物都有不同的作用，包括抑制炎症、抑制導緻瘢痕的膠原蛋白的生成，以及促進神經纖維、血管和肌肉的新生長。這種組合和生物反應器提供了一種積極的信号，使受損組織向再生層面傾斜。

再生的組織和骨骼特征與自然肢體的骨骼結構相似，包含豐富的内部組織（包括神經元），并可以對刺激做出反應。因此，該研究成為恢複完整肢體功能的一個重要裡程碑，并提示進一步探索藥物和生長因子的組合可能會使得再生的肢體功能更加完整。

本研究第一作者Nirosha J. Murugan博士說：「看到我們選擇的藥物幫助創造了一個幾乎完整的肢體，這是非常令人興奮的。事實上，隻需要短暫的藥物接觸，就可以啟動一個長達數月的再生過程，這表明青蛙和其他動物可能有潛在的再生能力，而這種再生能力是可以被激發的。」

通訊作者Michael Levin教授說：「接下來，我們将測試這種治療方法是否同樣應用于哺乳動物，被BioDome覆蓋的開放傷口，可以為啟動再生過程提供必要的第一個信号。」

題圖來源：來自Flickr，僅用于學術交流

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參考資料：

[1]Murugan NJ, Vigran HJ, Miller KA, et al. Acute multidrug delivery via a wearable bioreactor facilitates long-term limb regeneration and functional recovery in adult Xenopus laevis. Sci Adv. 2022 Jan 28;8(4):eabj2164. doi: 10.1126/sciadv.abj2164. Epub 2022 Jan 26. PMID: 35080969.

[2]Joven A, Elewa A, Simon A. Model systems for regeneration: salamanders. Development. 2019 Jul 22;146(14):dev167700. doi: 10.1242/dev.167700. PMID: 31332037; PMCID: PMC6679358.

[3]Johnson GL, Masias EJ, Lehoczky JA. Cellular Heterogeneity and Lineage Restriction during Mouse Digit Tip Regeneration at Single-Cell Resolution. Dev Cell. 2020 Feb 24;52(4):525-540.e5. doi: 10.1016/j.devcel.2020.01.026. PMID: 32097654; PMCID: PMC7186907.

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