一、試劑準備

1. SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。

2. 勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。

6. 顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 ul。

二、蛋白樣品制備

1. 單層貼壁細胞總蛋白的提取

（1） 倒掉培養液，并将瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸幹培養液（或将瓶直立放置一會兒使殘餘培養液流到瓶底然後再用移液器将其吸走）。

（2） 每瓶細胞加3 ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞，然後棄去洗液。重複以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。将PBS棄淨後把培養瓶置于冰上。

（3）按1ml裂解液加10 ul PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）

（4） 每瓶細胞加400 ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。

（5）裂解完後，用幹淨的刮棒将細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然後用槍将細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）

（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機預冷）

（7） 将離心後的上清分裝轉移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。

2. 組織中總蛋白的提取

（1）将少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用幹淨的剪刀将組織塊盡量剪碎。

（2） 加400 uL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進行勻漿。然後置于冰上。

（3）幾分鐘後再碾一會兒再置于冰上，要重複碾幾次使組織盡量碾碎。

（4） 裂解30 min後，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml離心管中，然後在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。

3. 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取

由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按1操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：

（1）将培養液倒至15 ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。

（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然後2500 rpm離心5 min。棄上清後用PBS重複洗滌一次。

（3）用槍洗幹上清後，加100 uL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。

（4）将裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。

三、 蛋白含量的測定

1. 制作标準曲線

（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化後，備用。

（2）取18個1.5 ml離心管，3個一組，分别标記為0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。

（3）按下表在各管中加入各種試劑。

（4） 混勻後，室溫放置2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。

2. 檢測樣品蛋白含量

（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1 ml。室溫放置30 min後即可用于測蛋白。

（2） 取一管考馬斯亮藍加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，将空白倒入比色杯中在做好标準曲線的程序下按blank測空白樣品。

（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無菌水洗一次。

（4）取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻後靜置2 min，倒入扣幹的比色杯中按sample鍵測樣品。

注意：每測一個樣品都要将比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是5 ml樣品含的蛋白量。

四、SDS－PAGE電泳

1. 清洗玻璃闆

一隻手扣緊玻璃闆，另一隻手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過後用自來水沖，再用蒸餾水沖洗幹淨後立在筐裡晾幹。

2. 灌膠與上樣

（1）玻璃闆對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）

（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然後膠上加一層水，液封後的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃闆流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）

（3）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙将水吸幹。

（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。将剩餘空間灌滿濃縮膠然後将梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃闆流下以免膠中有氣泡産生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固後，兩手分别捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕将其拔出。

（5）用水沖洗一下濃縮膠，将其放入電泳槽中。（小玻璃闆面向内，大玻璃闆面向外。若隻跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料闆且有字的一面面向外。）

（6）測完蛋白含量後，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 ul，加樣孔的最大限度可加20 ul樣品。）上樣前要将樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。

（7） 加足夠的電泳液後開始準備上樣。（電泳液至少要漫過内測的小玻璃闆。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，将樣品吸出不要吸進氣泡。将加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。

3. 電泳

電泳時間一般4～5 h，電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。

五、轉膜

1. 轉一張膜需準備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。将切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿裡，要使膜浮于水上，隻有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水裡，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。

2. 在加有轉移液的搪瓷盤裡放入轉膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

3. 将夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回擀幾遍以擀走裡面的氣泡。（一手擀另一手要壓住墊子使其不能随便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒擀去其中的氣泡。

4. 要先将玻璃闆撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反複撬。撬一會兒玻璃闆便開始松動，直到撬去玻闆。（撬時一定要小心，玻闆很易裂。）除去小玻璃闆後，将濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒擀去氣泡。将膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下後不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最後蓋上另一個海綿墊，擀幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的擀去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸後會發生短路。（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。）

5. 将夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會産熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉移2 h或40 V轉移3 h。

6. 轉完後将膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然後用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾幹備用。

六、免疫反應

1 . 将膜用TBS從下向上浸濕後，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。

2. 将一抗用TBST稀釋至适當濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下适當大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗台面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；将抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液後，将膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h後，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。

3. 同上方法準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h後，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，進行化學發光反應。

七、化學發光，顯影，定影

1. 将A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min後，将膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min後，将膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。

2. 在暗室中，将1×顯影液和定影液分别到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁适當大小（比膜的長和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上X-光片夾，開始計時；根據信号的強弱适當調整曝光時間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成後，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶後，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過低時（低于16℃）需适當延長顯影時間；顯影結束後，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10 min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液後，室溫下晾幹。

應注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結果産生影響。

八、凝膠圖象分析

将膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目标帶的分子量和淨光密度值。

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