pcr技術的基本原理?實驗方法原理：實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信号積累實時監測整個PCR進程，最後通過标準曲線對未知模闆進行定量分析的方法，現在小編就來說說關于pcr技術的基本原理?下面内容希望能幫助到你，我們來一起看看吧!

pcr技術的基本原理

實驗方法原理：

實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信号積累實時監測整個PCR進程，最後通過标準曲線對未知模闆進行定量分析的方法。

實驗步驟：

一、 樣品RNA的抽提

1. 取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心後混合液體将分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

3. RNA沉澱 将水相上層轉移到一幹淨無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鐘後，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉澱将在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。

4. RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。

5. RNA幹燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-10分鐘。

6. 溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反複吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、 RNA質量檢測

1. 紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液将分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

（1）濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5 μl，1:100稀釋至495 μl的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5 ul用來測量以後，剩餘樣品RNA為35 μl，剩餘RNA總量為：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值範圍1.8到2.1。

2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定

（1）制膠

1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4 M MOPS，pH 7.0

0.1 M 乙酸鈉

0.01 M EDTA

灌制凝膠闆，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝後取下梳子，将凝膠闆放入電泳槽内，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

（2）準備RNA樣品

取3 μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

（3）電泳

上樣前凝膠須預電泳5 min，随後将樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。

（4）紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，将會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

三、樣品cDNA合成

1. 反應體系

序号 反應物 劑量

1 逆轉錄buffer 2 μl

2 上遊引物 0.2 μl

3 下遊引物 0.2 μl

4 dNTP 0.1 μl

5 逆轉錄酶MMLV 0.5 μl

6 DEPC水 5 μl

7 RNA模版 2 μl

8 總體積 10 μl

輕彈管底将溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

2. 混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃幹浴3分鐘，取出後立即冰水浴至管内外溫度一緻，然後加逆轉錄酶0.5 μl，37℃水浴60分鐘。

3. 取出後立即95℃幹浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、 梯度稀釋的标準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR

1. β-actin陽性模闆的标準梯度制備 陽性模闆的濃度為1011，反應前取3 μl按10倍稀釋（加水27 μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

2. 反應體系如下：

标準品反應體系

序号 反應物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 μl

2 陽性模闆上遊引物F 0.5 μl

3 陽性模闆下遊引物R 0.5 μl

4 dNTP 0.5 μl

5 Taq酶 1 μl

6 陽性模闆DNA 5 μl

7 ddH2O 32.5 μl

8 總體積 50 μl

輕彈管底将溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

3. 管家基因反應體系：

序号 反應物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 μl

2 内參照上遊引物F 0.5 μl

3 内參照下遊引物R 0.5 μl

4 dNTP 0.5 μl

5 Taq酶 1 μl

6 待測樣品cDNA 5 μl

7 ddH2O 32.5 μl

8 總體積 50 μl

輕彈管底将溶液混合， 6000 rpm短暫離心。

3. 制備好的陽性标準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然後93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。

五、 制備用于繪制梯度稀釋标準曲線的DNA模闆

1. 針對每一需要測量的基因，選擇一确定表達該基因的cDNA模闆進行PCR反應。

2. 反應體系

序号 反應物 劑量

1 10× PCR緩沖液 2.5 ul

2 MgCl2 溶液 1.5 ul

3 上遊引物F 0.5 ul

4 下遊引物R 0.5 ul

5 dNTP混合液 3 ul

6 Taq聚合酶 1 ul

7 cDNA 1 ul

8 加水至總體積為 25 ul

輕彈管底将溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。

（3）PCR産物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR産物是否為單一特異性擴增條帶。

（4）将PCR産物進行10倍梯度稀釋: 将PCR産物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR産物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR

1. 所有cDNA樣品分别配置實時定量 PCR反應體系。

2. 體系配置如下：

序号 反應物 劑量

1 SYBR Green 1 染料 10 ul

2 上遊引物 1 ul

3 下遊引物 1 ul

4 dNTP 1 ul

5 Taq聚合酶 2 ul

6 待測樣品cDNA 5 ul

7 ddH2O 30 ul

8 總體積 50 ul

輕彈管底将溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

（3）将配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃ 2分鐘預變性，然後按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，最後72℃7分鐘延伸。

七、 實時定量PCR使用引物列表

引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模闆的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模闆的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。

八、電泳

各樣品的目的基因和管家基因分别進行Realtime PCR反應。PCR産物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR産物是否為單一特異性擴增條帶。

注意事項：

1.熒光阈值：在熒光擴增曲線指數增長長期設定一個熒光強度标準（即PCR擴增産物量标準）。熒光阈值可設定在指數擴增階段任意位置上，但實際應用要結合擴增效率，線性回歸系數等參數來綜合考慮。

2.Ct值：在PCR擴增過程中，擴增産物（熒光信号）到達阈值時所經過的擴增循環次數。Ct值具有極好的重複性。

其他：

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量隻能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信号的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據标準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需内标是建立在兩個基礎之上的：

1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模闆不同時間擴增或同一時間不同管内擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模闆的線性關系由于Ct值與起始模闆的對數存在線性關系，可利用标準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外标準曲線定量的方法。

外标準曲線的定量方法相比内标法是一種準确的、值得信賴的科學方法。利用外标準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準确，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

北京澤平科技18年專業PCR技術供應服務，現部分儀器可免費申請試用，歡迎咨詢！

産品列表：

編輯于 2020-10-26 · 著作權歸作者所有

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