上次和大家分享了蛋白定量的Lowry法，今天先給大家介紹一下Bradford法。

實驗原理

考馬斯亮藍G250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G250在酸性溶液中呈棕紅色，最大吸收峰在465nm，當與蛋白質結合時變為藍色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系數更大，在一定範圍内反應液在595nm處吸光度的變化量與反應蛋白量成正比，此時測定595nm處吸光度的增加量可以對蛋白進行定量；蛋白質與考馬斯亮藍結合在2min左右的時間内達到平衡，完成反應迅速；其結合物在室溫下1h内保持穩定。（染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合）

實驗器材和試劑

1. 可見光分光光度計，旋渦混合器。

2. Brandford貯存液：100 mg考馬斯亮藍G250 溶于 50 mL 95%乙 醇 中 ，然 後 與100 mL 85%磷酸混合，用雙蒸水稀釋定容至 1L。

3. 标準蛋白溶液：用牛血清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml的标準蛋白質溶液。

實驗步驟一、标準曲線的制作

1. 取7支試管，1支作為空白（第1号），其餘試管（第2-7号）按如下順序，分别加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的标準蛋白質溶液給各試管分别加入:0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然後用雙蒸水補充到0.1ml。最後各試管中分别加入5.0ml考馬斯亮蘭G250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合，渦旋不要太劇烈，以免産生大量氣泡而難于消除。

2. 加完試劑2~5分鐘後，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A595，空白對照為第1号試管，即0.1mlH2O加5.0mlG250試劑。PS:不可使用石英比色皿，可用塑料或玻璃比色皿，使用後立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。

3. 用标準蛋白質量(mg)為橫座标，用吸光度值A595為縱座标，作圖，即得到一條标準曲線。（如圖）

靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1ug。這是因為蛋白質與染料結合後産生的顔色變化很大，蛋白質-染料複合物有更高的消光系數，因而光吸收值随蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。

測定快速、簡便，隻需加一種試劑。完成一個樣品的測定，隻需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約隻要2分鐘即可完成，其顔色可以在1小時内保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顔色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。

幹擾物質少。如幹擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不幹擾此測定法。

二、缺點

1. 由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作标準曲線時通常選用 g球蛋白為标準蛋白質，以減少這方面的偏差。

2. 仍有一些物質幹擾此法的測定，主要的幹擾物質有:去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸幹擾Lowary法一樣)。

3. 标準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而隻能用标準曲線來測定未知蛋白質的濃度。

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