2017年2月份，鐵嶺市某豬場豬突然發病，1月齡以内的哺乳仔豬和斷奶仔豬主要症狀為體溫升高達40 ℃以上，呼吸困難，采食量和飲水量都明顯下降，有些仔豬眼睑水腫。育肥豬除了和仔豬有同樣症狀外還出現咳嗽、呼吸困難、雙耳及腹部皮膚呈深紫色、眼部腫脹有結痂的症狀；母豬主要症狀為精神萎靡、嗜睡、食欲不振、體溫升高；妊娠母豬則發生流産、早産、産死胎或木乃伊胎，還有産後無乳、胎衣不下等症狀。剖檢病死豬可見肺部呈暗紅色，肝樣變，肺小葉間質明顯增寬，切面流出多量液體。此次發病死亡的豬主要是哺乳仔豬和斷奶仔豬，育肥豬死亡較少，母豬未發生死亡。根據上述臨床症狀和剖檢病變初步診斷患豬為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染。為了進一步确診，采集了4頭死亡仔豬的病料進行了實驗室診斷，現報道如下。

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材料

1.1　病料

4頭發病仔豬的肺髒、脾髒和淋巴結，采自鐵嶺市某豬場。

1.2　主要試劑

氯仿、異丙醇、無水乙醇，均購自沈陽農業大學國有資産管理處；TRIzol，購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒等，購自寶生物工程（大連）有限公司；DEPC水，購自索萊寶生物科技有限公司。

1.3　主要儀器

PCR 基因擴增儀，杭州博日科技有限公司生産；4 ℃離心機，Thermo Fisher公司生産。

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方法

2.1　引物的設計與合成

根據GenBank中PRRSV 的Ｎ 基因序列設計并合成了一對特異性引物。序列為：上遊引物F 5′-TAAATATGCCAAATAACAAC-3′，下遊引物R 5′-TAGGTGACTTAGAGGCACAGT-3′，擴增片段長度為430 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.2　病料的處理

将采集的豬肺髒和淋巴結剪碎，混合後放入用液氮預冷過的研缽中，加入１～2 mL 無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）研磨，制成組織懸液，然後将研碎的病料加到2 mL 的除酶離心管中，3 000 r/min 離心5 min，取上清液200 µL用于提取RNA。

2.3　病毒RNA的提取

向200 µL 的上清液中加入TRIzol 800 µL，充分振蕩，冰上靜置10 min；加入TRIzol體積1/5的氯仿溶液，充分振蕩，冰上靜置5 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min；然後緩慢取出，吸取上層水相400 µL，加到2 mL 離心管中，再加入等體積的異丙醇，颠倒劇烈振蕩使其混勻；４ ℃ 靜置20 min，然後12 000 r/min離心10 min；緩慢棄去上清液，加入與TRIzol等體積的用EDPC水配制的乙醇溶液，漩渦振蕩，4 ℃、10 000 r/min離心5 min；棄去上清液，倒置5 min 後加入EDPC水20 µL ，測RNA 濃度并調整模闆濃度為100 ng～1 µg。

2.4　病毒RNA的反轉錄

反轉錄體系中氯化鎂（MgCl2） 4 µL，10×反轉錄Buffer 2 µL，RNase Free ddH2O 8 µL，dNTP Mixture 2 µL，反轉錄酶1 µL，随機引物1 µL，樣本模闆 2 µL，振蕩均勻後進行如下程序：30 ℃保溫10 min，42 ℃退火 15 min,95 ℃ 5 min使反轉錄酶失活,5 ℃保存5 min。

2.5　PCR檢測

反應體系（10 µL）：2×ES Taq Master Mix 5 µL，上、下遊引物各0.4 µL，cDNA模闆1 µL，ddH2O 3.2 µL。反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃終延伸2 min，4 ℃保溫2 min。将PCR産物在1%瓊脂糖凝膠中120 V電泳25 min。取出後在紫外凝膠成像儀中觀察結果。将陽性PCR 産物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，然後進行BLAST比對。

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結果與分析

3.1　PCR 檢測

結果見圖１。

M. DL-1 000 Marker；Y.PRRSV陽性對照；1～4.疑似病料；K.空白對照。

圖1　PRRSV N基因片段擴增結果

從圖1看可見，在430 bp 處出現目的條帶，與預期條帶大小相符。

3.2　BLAST 比對結果

PCR産物序列測定結果與NCBI核酸數據庫中PRRSV序列進行BLAST比對，結果與參考毒株（登錄号為KX758249.1）相似率高達95%，說明本次豬場豬發病是由PRRSV引起的。

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讨論

目前檢測PRRSV的方法有很多，其中RT-PCR法是一種高效、便捷、特異的方法。由于豬繁殖與呼吸綜合征在臨床症狀和剖檢變化上與某些疾病很相似，所以在診斷該病時僅依靠臨床診斷是不夠的，必須結合實驗室診斷才能确診。本次豬場發病後，在初步臨床診斷基礎上從發病豬場采集病料進行RT-PCR診斷，然後又進行了序列測定，最後确診該豬場豬隻發病是由PRRSV引起的。豬繁殖與呼吸綜合征是一種常見的呼吸道疾病，多發生于夏季和秋季，發病快且發病率和死亡率高，傳染源主要為發病豬或帶毒豬，帶毒豬的特點是可以向環境中持續排毒。該病還具有免疫抑制作用，易造成其他疾病的混合感染或繼發感染。目前對該病的防控主要是采用疫苗接種的方法，由于PRRSV 容易發生變異，所以在疫苗的選擇上要根據當地疫病流行情況選擇恰當疫苗株接種。同時還要選擇适當藥物預防，防止細菌繼發感染。

作者 | 趙一霏　李　帥　沈國順

沈陽農業大學畜牧獸醫學院

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