引言

通過泛素蛋白酶體系統降解疾病相關蛋白的靶向蛋白降解嵌合體(PROTACs)已成為藥物發現領域的革命性技術。當前多數PROTAC對靶蛋白和E3連接酶均使用可逆非共價配體。本綜述則詳盡探讨了共價配體(包含可逆和不可逆)在蛋白降解(TPD)中的作用及優勢。

共價抑制劑

市場上約有60%的藥物直接來自于天然産物，而許多天然産物則通過各種親電彈頭與靶标形成共價鍵來結合。但出于對共價藥物脫靶及潛在毒性的擔憂，共價藥物的發展在很長一段時間内陷入停滞，随着越來越多廣泛使用藥物(阿司匹林、青黴素、奧美拉唑等)的共價機制被闡明及邁克爾受體類化合物(阿法替尼等)被成功應用，共價抑制劑才逐漸複蘇且發現過程由偶然變得理性。與非共價抑制劑相比，靶向共價抑制劑(TCIs)的優點是顯而易見的：高效力和高選擇性，更少給藥量，靶向難藥靶标及避免耐藥突變等。

共價反應機理有兩步，第一步分子骨架與靶标形成高親和力的可逆複合物，速率為Ki。然後彈頭與親核殘基形成共價鍵，速率為k2。對不可逆抑制劑來說，k-2=0， k-2則代表了共價複合物EI返回非共價複合物E·I的趨勢，當k-2不等于0時，為可逆抑制劑。(圖1)

最近，無論是對靶蛋白還是E3連接酶，可逆和不可逆TCI在靶向蛋白降解領域的應用都大有勢頭。本文旨在展示這項策略的優勢及潛力，以進一步擴大蛋白降解的靶标範圍。

圖1. 共價抑制劑的反應機理

圖片來源于Cell Chem. Biol.

PROTAC

PROTAC是一個兩頭含有不同配體的化學分子，一頭是結合E3連接酶的配體，另一頭是結合細胞内蛋白的配體，這兩個配體再由一段linker連接起來。這樣的化學分子既可以結合E3泛素連接酶，又可以結合胞内蛋白，通過把靶蛋白招募到E3泛素連接酶附近來實現靶蛋白的多泛素化，最後被26S蛋白酶體降解。(圖2)

圖2. PROTAC介導的靶标降解的催化機理

圖片來源于Cell Chem. Biol.

小分子抑制劑需持續占據靶蛋白的活性位點以阻斷功能，屬于“占位驅動”,因此需要藥物劑量夠大使靶點飽和；半衰期夠長能持續抑制；親和力夠高能競争過底物。這些要求帶來一系列問題，如毒副作用，脫靶毒性及耐藥。而PROTAC機制則是“事件驅動”，隻提供結合活性，觸發靶蛋白和E3酶結合從而引發降解，不需要直接抑制靶蛋白功能活性也不需要藥物與靶蛋白長時間高強度地結合。具有靶向難藥靶标的潛力并可減少毒副作用。

PROTAC迄今為止已成功降解的靶标種類有：激酶、多通道跨膜蛋白、細胞表面蛋白(PD-1)的溶酶體。另有兩個分别針對雄激素受體和雌激素受體的PROTAC，ARV-110和ARV-471，目前進入治療前列腺癌和乳腺癌的一期臨床。一種治療阿爾茨海默症的TATAC甚至被證明穿過了血腦屏障。對于這些不符合類藥五規則的化合物來說是一個令人印象深刻的壯舉。這些結果表明PROTAC方法有開發有效療法的巨大潛力。

與靶蛋白不可逆共價結合的PROTAC

與靶标不可逆地共價結合，将消除PROTAC機制的上述優勢。第一個PROTAC-1通過與MetAP-2共價結合來完成降解但因其E3連接酶募集部分滲透性差故并沒有進行細胞測試。從那時起，關于PROTAC與靶标共價結合的報道就逐漸變少，可能是因為從藥代動力學優化角度看失去了催化靶标轉化這一重大缺點。而且對這類的功效一直有争議甚至對同個靶标降解有相互矛盾的報道。最近又有PROTAC用共價彈頭成功降解靶蛋白的成功報道，包括ERK1/2、BTK和KRASG12C。

用小分子抑制劑靶向BTK已成為治療CLL的一種有效驗證的治療策略。一線藥物依魯替尼使用丙烯酰胺親電彈頭不可逆地與BTK激酶結構域中的Cys481結合。為了評估共價結合對PROTAC介導的BTK降解的影響，Tinworth等人合成了非共價和基于依魯替尼的共價PROTAC用于比較研究，招募E3酶的配體來自凋亡蛋白抑制劑IAP。共價PROTAC2和可逆PROTAC3在生化分析中顯示出對BTK的抑制作用但前者在細胞測試中并未觀察到BTK降解，更換招募E3酶的配體為結合CRBN配體時也出現了類似的結果。于是作者得出結論共價鍵會抑制靶标降解，這是由于泛素轉移到表面賴氨酸的損傷或阻礙了蛋白酶體識别所需的靶蛋白内在無序區域的呈現。薛等人的最新報告提出了一種成功降解BTK的共價PROTAC。合成的一系列PROTAC利用了兩種與BTK結合部分不同的共價配體：依魯替尼類似物和PLS-123，兩者親和力高且骨架有顯著差異，招募E3酶的配體也有兩種，分别結合CRBN和VHL。基于依魯替尼類似物的CRBN PROTAC的BTK降解水平為50%，基于PLS-123的CRBN PROTAC則可以提高降解水平到75%。後續更換招募配體為VHL032時，比結合CRBN的配體降解BTK的水平更高，基于依魯替尼的PROTAC最大BTK降解達到88%。将丙烯酰胺彈頭更換為飽和的丙酰胺後的PROTAC9為可逆化合物，細胞實驗表明，共價PROTAC7降解BTK的程度更大，此外，對BTK的IC50值表示PROTAC7是更有效的BTK抑制劑和降解劑。(圖3)

另一種說法認為，這些研究的差異可能與靶标降解和共價鍵形成的相對速率有關，Gabizon等觀察到他們的IR-2形成共價鍵的速率慢于BTK降解速率，這很可能是由于丙烯酰胺的反應性較低。野生型和C481S突變體BTK之間不可逆PROTAC的降解功效沒有顯著差異，表明共價鍵沒有參與，即在共價鍵還沒形成時PROTAC便完成了BTK的降解。Riching的研究則支持了這一理論，他們發現靶标降解的初始速率與形成的三元複合物的穩定性和協同性呈正相關。因此，可能的說法是，已成功降解靶标的共價PROTAC是因為形成穩定的三元複合物，降解速率快于共價鍵形成速率，而共價鍵的形成則損害了靶标的降解導緻三元複合物不穩定進而出現降解失敗的PROTAC。

圖3. 與靶蛋白不可逆共價結合的PROTAC

圖片來源于Cell Chem. Biol.

與E3連接酶不可逆共價結合的PROTAC

與靶标共價結合的PROTAC可能是有效的降解劑但其失去了催化轉化靶标的能力。但是，使用共價配體募集E3酶的PROTAC可能保留了共價結合和催化轉化靶标的所有藥代動力學優勢。

在人類基因組編碼的約600種E3酶中，成功的蛋白降解劑募集的不到10種，其中隻有4種被廣泛靶向：CRBN,VHL,IAP和MDM2。這主要是由于小分子配體的缺乏。最近人們發現了先前未靶向的E3連接酶的新配體，特别是最近已驗證的E3酶RNF114,RNF4和DCA16的共價配體，與可逆E3酶募集配體相比更有優勢。

使用nimbolide作為PROTAC的E3連接酶招募配體會産生有益的協同作用，從而降解靶蛋白，并通過與RNF114的Cys8共價結合來穩定抑癌基因p21和p57，實驗表明抑制二者的泛素化和降解可以促進其穩定，而它們的穩定化有助于nimbolide的抗癌作用。Tong等人已證明可将nimbolide摻入降解劑中以成功募集RNF114并降解BRD4。募集MDM2的PROTAC也采用了類似的協同策略，比募集VHL的PROTAC具有更強的抗增殖作用且對相同靶标(BRD4)具有相似的降解能。為擴展招募RNF114的共價配體庫，Nomura使用ABPP方法篩選了針對RNF114的Cys反應性的共價配體庫，發現了EN62，該片段與nimbolide結合位點一緻但需要對其通透性及選擇性等進行優化。它為未來RNF114共價配體優化提供了一個良好的起點。CCW16是E3連接酶RNF4的抑制劑(IC50=1.8µM),CCW16與JQ1連接形成的PROTAC CCW28-3在競争性ABPP分析中對RNF4的效力比原配體CCW16更高，IC50為0.54µM。對同源BET家族成員BRD2和BRD3沒有降解表明其優越的選擇性，且将RNF4敲除後并未觀察到CCW 28-3介導的BRD4降解，進一步支持了CCW 28-3的RNF4募集機制。實驗發現DCAF16的減少會顯著削弱片段降解劑KB02-SLF(彈頭為氯乙酰胺)介導的多泛素化合核FKB12的降解，作者還試圖研究DCF16募集是否會導緻其他核蛋白如BRD4的降解,結果表明PROTAC KB02-JQ1成功促進了HEK293T細胞中BRD4呈劑量依賴性降解，在DCAF16敲除細胞中降解明顯減弱。這些研究強調了這些廣泛反應的共價片段的實用性，可成為開發缺少配體的E3連接酶的配體的有價值的起點。(圖4)

圖4. 與E3連接酶不可逆共價結合的PROTAC

圖片來源于Cell Chem. Biol.

與靶蛋白可逆共價結合的PROTAC

可逆共價PROTAC的研究也是在BTK靶标上研究的，隻是與靶蛋白共價結合的彈頭由不可逆的丙烯酰胺變為可逆的氰基丙烯酰胺。理論上講，可逆共價PROTAC有不可逆共價PROTAC不具有的亞單位的靶标轉化。

為比較不同彈頭對靶标降解的影響，郭及同事設計了3種BTK PROTAC:RNC-1,RC-1和IRC-1，分别與BTK形成可逆非共價鍵，可逆共價鍵和不可逆共價鍵。細胞實驗表明IRC-1誘導BTK降解的效率不高但RNC-1和RC-1均成功誘導了BTK降解，且低濃度上RC-1比RNC-1更有效。改變linker長度後發現最初的RC-1效果是最好的，是迄今為止最有效的BTK降解劑之一，DC50為6.6nM。生化抑制試驗也有類似的結果。通過計算PROTAC的胞内濃度發現，RC-1在細胞内的蓄積比不可逆共價和可逆非共價高10倍和16倍，C=C被還原或氰基被去除的化合物作為對照，RC-1的胞内積累比對照物也要高5倍。這些結果表明，RC-1誘導的有效BTK降解及生長抑制主要歸因于其高胞内濃度，突出了氰基丙烯酰胺的重要性。(圖5)

圖5. 與靶标可逆共價結合的PROTAC

圖片來源于Cell Chem. Biol.

與E3連接酶可逆共價結合的PROTAC

Tong等人在共價E3連接酶配體的成功上，決定探索可逆E3連接酶的募集來達到避免永久性的蛋白修飾和潛在的毒性。CDDO-Me通過α-氰基烯酮部分與E3連接酶KEAP1的Cys形成可逆共價鍵。該活性還導緻Nrf2的活化，Nrf2是氧化應激的主要調控因子，在疾病狀态下被KEAP1異常泛素化，降解和抑制。因此，招募KEAP1的PROTAC可能表現出類似穩定p53的RNF114-PROTAC的有益協同機制。将CDDO通過linker連接到BET抑制劑JQ1上，該抑制劑以蛋白酶體依賴性方式成功降解了BRD4,成為第一個使用可逆共價配體募集E3連接酶的PROTAC，擴大了可配體E3連接酶的範圍。(圖6)

圖6. 與E3連接酶可逆共價結合的PROTAC

圖片來源于Cell Chem. Biol.

總結

本文回顧了可逆和不可逆化學在TPD中的最新作用，衆多研究表明，使用可逆共價化學或不可逆共價抑制劑的PROTAC可能是高效的降解劑，尤其是可逆共價化學結合了共價結合和催化靶标轉化的優勢，還有其獨特的優勢如更高選擇性及改善藥物傳遞的潛力。期望在這領域取得進一步進展來闡明共價PROTAC的機制，并利用其潛力來攻克更多的難成藥靶标。

參考文獻

Kiely-Collins, H., Winter, G. E., Bernardes, G. J. L., The Role of Reversible and Irreversible Covalent Chemistry in Targeted Protein Degradation, Cell Chem. Biol. 2021, In press. DOI: 10.1016/j.chembiol.2021.03.005

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