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自Journal of agricultural and food chemistry上

的“

Biochemical Characterization of a Novel Acidic Exochitinase from Rhizomucor miehei with Antifungal Activity

”作者為中國農業大學食品科學與營養工程學院楊紹青等人。

幾丁質酶(EC3.2.1.14)是一種幾丁質水解酶，催化幾丁質材料主幹中β-1,4-糖苷鍵的裂解，是地球上第二豐富的生物量。由于幾丁質酶具有其降解真菌細胞壁和昆蟲外骨骼中甲殼素的獨特能力，因此在不同的生物技術應用中獲得了極大的興趣，如n-乙酰甲殼寡糖的生産、幾丁質廢物轉化為生物乙醇、真菌植物病原體的生物防治等。

作者克隆了米黑根黴的新幾丁質酶基因(RmChi44)，并作為細胞内可溶性活性蛋白在大腸杆菌中表達。重組幾丁質酶(RmChi44)經過同質純化，并進行了生化表征。在SDS-PAGE上估計RmChi44的分子量為44.6kDa。RmChi44的酸性pH值為4.5，pH值在4.5−9.0内穩定。RmChi44的最佳溫度為50°C。膠體幾丁質和乙二醇幾丁質的RmChi44的Km值分别為4.02mg/mL和1.55mg/mL。RmChi44水解膠體幾丁質，主要生成n-乙酰基殼二糖，表現出外型裂解模式。此外，該酶顯示β-N乙酰氨基葡萄糖酶活性，以聚合度(DP)2−5将N-乙酰COSs分裂成單體。此外，RmChi44對某些植物病原真菌具有抗真菌活性。這是第一個關于顯示β-n-乙酰氨基葡萄糖酶活性和抗真菌活性的報道。

幾丁質酶基因在大腸杆菌中的表達

為了在大腸杆菌中表達幾丁質酶基因，采用引物RmChiF(5′ATCATGCCATGGCTCCATCATCGAACTCTACTACTGACAC3′)RmChiR(5′ATTCCGCTCGAGACATTTCGATGATTTTGTCGAGCCT-3′).進行PCR擴增cDNA的ORF區域将NcoI和XhoI位點分别添加到正向引物和反向引物中。PCR條件如下：94°C熱啟動5min，30個周期94°C30s，55°C30s，72°C1min，然後是一個周期72°C10min。純化後的PCR産物經NcoI和XhoI酶切，亞克隆到pET-28a（ ）載體中，轉化到大腸杆菌BL21(DE3)感受态細胞中進行蛋白表達。将轉化子接種到含有卡那黴素的LB(50mg/mL)培養基中，以37°C，200rpm的轉速孵育。培養液光密度(OD600)達到0.6−0.8後，加入異丙基β-D-硫代甘氨基苷(IPTG)，最終濃度為1mM，在30°C下培養12h。

重組幾丁質酶的純化

将粗酶應用于Ni−IDA柱(10×1cm)上，用緩沖液A(50mMTris-HClpH8.0，含20mM咪唑和500mM氯化鈉)預平衡。未結合蛋白用緩沖液A洗滌，然後用緩沖液B(50mMTris-HClpH8.0，含50mM咪唑和500mM氯化鈉)去除弱結合雜質。結合蛋白用緩沖液C(50mMTris-HClpH8.0，含200mM咪唑和500mM氯化鈉)洗脫。所有的純化過程均在4°C下進行，流速為1mL/min。收集幾丁質酶活性高的洗脫組分。

純化酶的天然分子質量通過在S-200HR柱(50×1cm)上進行凝膠過濾，用含有150mM氯化鈉的50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)預平衡，流速為0.3mL/min。用于校準的分子質量标準中含有磷酸化酶b(97.2kDa)、胎牛血清中的胎蛋白（68.0kDa)、雞蛋清中的白蛋白(45.0kDa)和糜蛋白酶原α(25.7kDa)。

幾丁質酶的水解性質

将1%(w/v)底物在50mM檸檬酸緩沖液(pH4.5)和1U/mL幾丁質酶在45°C下孵育8小時，分析純化的幾丁質酶對膠體幾丁質和n-乙酰COSs(DP2−5)的水解性能。在不同時間間隔提取的等分液立即煮沸10min，然後進行薄層色譜分析。樣品被發現在薄層色譜矽膠闆上上，使用丁醇−乙酸−水中（2：1：1，v/v/v）溶劑系統，然後噴灑溶液I[12.5%（w/v）氫氧化鉀乙醇和1%（v/v）乙酰丙酮1：20]，然後幹燥，噴灑溶液II[3.33%（w/v）二甲基氨基苯甲醛乙醇−6：6：1（v/v/v）後，在烤箱中加熱。

抗真菌活性測定

通過菌絲延伸抑制試驗測定了純化的幾丁質酶的抗真菌活性。所選植物病原真菌為綠木黴(CGMCC3.3711)、黃黴(CGMCC3.3114)、灰赤黴(CGMCC3.3789)、尖孢鐮刀菌(CGMCC3.2832)、茄鐮刀菌(CGMCC3.3639)、炭疽菌。(CGMCC3.3484)和茄根核菌(CGMCC3.2888)分别在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養皿(直徑100mm)中心培養。當菌絲菌落發展到直徑10−20毫米，不同數量的純化幾丁質酶(0、20和100μg醋酸緩沖液pH4.5)被發現在無菌紙盤（直徑6毫米）距離5毫米遠離菌絲菌落的邊緣。然後将培養皿在30°C下進一步孵育，直到菌絲生長得到包含控制區的包膜圓盤。

酶的表達和純化

從CAU432基因組DNA中克隆了幾丁質酶基因(RmChi44)，并在大腸杆菌中表達。重組幾丁質酶(RmChi44)的純化具有明顯的均勻性，純化倍數為3.3倍，回收率為40.9%。通過SDS-PAGE和凝膠過濾，估計該純化酶的分子量分别為44.6和44.7kDa，表明該酶是一種單體蛋白。

RmChi44的生化特性

RmChi44在pH值為4.5時最活躍，在pH4.5−9.0範圍内保持穩定，在不同的緩沖液中處理30min後，其80%以上的活性被保留(圖4B)。重組幾丁質酶的最适溫度為50°C(圖4C)，并在達到50°C時保持穩定(圖4D)。該酶在45、50、55和60°C下的熱變性半衰期分别為1209、324、62和38min(圖4E)。

ca2 （165.4%）和Ni2 （130.3%）顯著提高了RmChi44的幾丁質酶活性。相反，Hg2 （34.1%）、Sn2 （53.7%）和Ag （65.9%），并被Mg2 （86%）、Zn2 （84.7%）、Co2 （80.3%）、Cu2 （76.3%）和Mn2 （73.8%）顯著抑制）。SDS、DTT、β-巯基乙醇等一些金屬離子對酶活性無顯著影響。

RmChi44的底物特異性和動力學參數

作者研究了RmChi44對不同底物的底物特異性（表2）。該酶對乙二醇幾丁質（18.1U/mg）表現出最高的比活性，其次是膠質幾丁質（11.9U/mg），對其他測試多糖的比活性較低，包括α-幾丁質（0.2U/mg）、β-幾丁質（0.1U/mg）、CMC（0.3U/mg）和殼聚糖（0.1U/mg）（表2）。在測試的N-乙酰COSs中，該酶對(GlcNAc)2（3.2U/mg）的比活性最高，其次是(GlcNAc)3（2.7U/mg）、GlcNAc4（1.9U/mg）和GlcNAc5（1.2U/mg）（表2）。此外，RmChi44對pNP-NAG也表現出相對較高的活性(3.6U/mg)。RmChi44對膠體幾丁質和乙二醇幾丁質的恒定動力學參數、Km和Vmax值分别為4.02mg/mL和12.7μmol/min/mg、1.55mg/mL和22.7μmol/min/mg（表3）。

RmChi44的水解性質

RmChi44水解膠體甲殼質，在初始水解階段(0−15min)僅産生(GlcNAc)2，然後随着孵育時間的延長(15−480min)釋放GlcNAc并積累(圖5A)。為了檢測(GlcNAc)2是否直接從膠殼質的非還原端釋放，我們用HPLC法進一步分析了膠殼質水解早期(2、4、8、12min)的水解産物。結果顯示，除(GlcNAc)2和微量的GlcNAc外，未檢測到其他産物。在反應結束時，(GlcNAc)2和GlcNAc是主要的水解産物(圖5A)。當使用N-乙酰COSs(DP2−5)作為底物時，RmChi44在反應結束時将底物完全轉化為單體(GlcNAc)(圖5B)，表明RmChi44具有β-N-乙酰氨基葡萄糖酶活性。

RmChi44的抗真菌活性

利用幾種植物緻病真菌培養皿評價RmChi44的抗真菌活性。RmChi44對炭疽菌、尖孢菌、茄僵菌和綠腐菌的生長有明顯的抑制作用，在幾丁質酶浸泡的紙盤周圍有明顯的抑制月形或區域。此外，抑制作用是劑量依賴性的。然而，即使在每盤100μg的濃度下，該酶對其他一些測試菌株，包括土孢杆菌、灰孢杆菌和茄蘭也沒有抗真菌活性。

綜上所述，作者克隆了一種新型CAU432的幾丁質酶(RmChi44)，并進行了生化表征。RmChi44是一個在SDS-PAGE上分子量為44.7kDa的單體。它在pH值為4.5和50°C時最為活躍。RmChi44主要通過外型裂解模式水解膠質甲殼素生成(GlcNAc)2。它顯示了獨特的β-N-乙酰氨基葡萄糖酶活性，将N-乙酰COSs轉化為其單體。此外，該酶對幾種被測試的病原真菌表現出較強的抗真菌活性。這些獨特的特性可能使該酶在工業中具有巨大的潛力，特别是作為一種農業領域的生物防治劑。

整理：高放

DOI: 10.1021/acs.jafc.5b05127

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