關于淘汰血清甲胎蛋白對流免疫電泳法和單擴散法

　　淘汰血清甲胎蛋白測定對流免疫電泳法和單擴散法的理由及替代方法

　　甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是胎兒肝髒和血清中的一種蛋白成份，在電泳圖譜上位于白蛋白與α1球蛋白之間，故名。正常人血清中AFP含量極微，一般在30ng／m1以下。80％以上原發性肝細胞癌患者血清AFP升高，明顯者超過200ng／m1。因此，血清AFP被作為肝癌的診斷标志而在臨床檢驗中進行檢測。檢測方法根據敏感度不同可分為兩大類。一類敏感度較低，其代表為對流免疫電泳法（敏感度100～300ng／m1）和瓊脂免疫擴散法[包括火箭免疫電泳法（敏感度350～2000ng／ml）]。這一類檢測方法在方法學上無特殊之處，均以抗AFP血清混入瓊脂凝膠闆内，在闆上打孔，加入受檢血清，進行免疫擴散或電泳，肉眼觀察沉澱線條以判斷結果。對流電泳為定性試驗，火箭電泳可作定量測定。兩者的缺點為敏感度太低，因而不能發現早期或血清AFP含量較低的肝癌。另外，如血清AFP含量過高，在對流電泳中可出現假陰性。這類方法用于臨床檢驗易引起漏診和誤診，應予以淘汰。

　　另一類方法敏感度較高，包括反向間接血凝試驗，放射免疫測定，放射火箭電泳自顯影，酶免疫測定等。如試劑質量符合要求，檢測敏感均可達20ng／ml以下。這些方法均适用于肝癌的輔助診斷，國内亦有試劑盒供應，可根據實驗室的條件和可得到的試劑的質量而選擇應用。以下推薦固相酶免疫測定法。

　　固相酶免疫測定法（ELISA）

　　為ELISA雙抗體夾心法技術。将抗AFP抗體包被ELISA反應闆微孔，加受檢血清标本，再加酶标記抗AFP抗體和酶底物。标本中如含有AFP，出現呈色反應，呈色深淺與AFP含量呈正相關。

　　有試劑盒供應，由以下各組份組成。

　　已包被抗AFP抗體的ELISA闆。辣根過氧化物酶（HRP）标記的抗AFP抗體。HRP底物。酶标抗體稀釋液。洗滌液。AFP參考标準液（定量測定用）。陽性和陰性對照血清。

　　因試劑盒組成的不同，在操作細節中可有差别。應嚴格按試劑盒所附說明書操作。基本步驟為下：

　　洗滌反應闆?用洗滌液洗滌已包被AFP抗體的ELISA闆。洗滌方法按說明書規定。加受檢标本和參考标準液（定量測定）及陰性、陽性對照血清，每孔加樣100μl。受檢血清及對照血清均不稀釋。定量測定中參考标準液濃度一般為：0、5、10、25、50、100、200、400ng／ml。置37℃水浴箱保溫l小時。吸幹各孔液體，洗滌3次。加酶标抗體應用液?按說明書配制酶标抗體應用液，每孔加100μl。置37℃水浴箱保溫45分鐘。吸幹各孔液體，洗滌4次。加底物液?按說明書配制底物液。常用的底物液含H202：和磷苯二胺（OPD），應現配；避光。每孔加100μl。定量測定置37℃水浴箱15分鐘。定性測定置室溫5―15分鐘。加2mol幾硫酸25μl終止反應。比色：（１）定性測定：肉眼觀察各孔呈色情況。底物空白和陰性對照孔應為無色或淺淡棕黃色。标本孔顔色深于陽性對照孔（30ng／ml）的結果為陽性。

　　（２）定量測定：用酶标儀進行比色。在波長492nm處讀取各濃度标準孔及各标本孔的吸光值。以AFP濃度為橫座标，以吸光值為縱座标，在半對數座标紙上繪制标準曲線。以測定孔的吸光值在标準曲線上查出相應血清标本的AFP含量。四、參考值

　　正常人血清AFP含量低于30ng／ml。

　　五、臨床意義

　　原發性肝細胞癌患者80％以上血清AFP升高。其他肝髒疾病如病毒性肝炎等，亦可出現血清AFP輕度升高，應注意鑒别。常以AFP含量＞200―400ng／ml作為肝癌診斷的臨界值，但早期肝癌患者血清AFP可僅高于正常參考值。睾丸癌患者血清AFP亦升高。孕婦血清AFP含量高于正常，懷孕13到15周達最高值，随後逐漸下降。胎兒患神經管缺損等畸形的孕婦，其血清AFP含量明顯高于懷正常胎兒的相同孕期的孕婦。

　　ELISA實施中影響因素甚多。應熟悉ELISA基本方法和各步操作中的注意事項，嚴格按規範操作，不可任意簡化。應注意所用試劑盒的質量。定性測定試劑盒有用一步法的，即受檢标本和酶标抗體同時加入。酶底物更宜采用四甲基聯苯胺（TMB），試劑更穩定，陰性本底淺，陽性呈藍色，肉眼易于判别。

　　（陶義訓曹錫坤）

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