握體外抗原抗體反應的特點和影響因素；

　　掌握經典的體外抗原抗體反應的原理、方法和應用。第一節免疫血清的制備免疫血清的制備是一項常用的免疫學實驗技術。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑（如用于制備免疫标記抗體等），也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價高低取決于實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應答性的機體，常可獲得高效價的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決于免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價的重要因素應予重視。基本原理具有免疫原性的抗原可刺激機體相應B細胞增殖、分化形成漿細胞并分泌特異性抗體。由于抗原分子表面的不同決定簇為不同特異性的B細胞克隆所識别，因此由某一抗原刺激機體後産生的抗體，實際上為針對該抗原分子表面不同決定簇的抗體混合物（即多克隆抗體）。本實驗以弗氏完全佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）為抗原，來制備家兔抗人IgG免疫血清。要求學生初步學會免疫原和佐劑的制作及免疫血清制備的基本方法，了解其意義和應用，熟悉動物實驗的基本知識。材料1、動物：健康成年家兔，雄性，體重2～3公斤。2、器材：剪刀、鑷子、注射器（2ml、50ml）附針頭（9号、6号）、稱量瓶（10ml）、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶（200ml）、手術器械一套、血管夾、黑絲線、塑料放血管等。3、試劑：滅菌生理鹽水；純化人IgG（10mg／ml）；消毒酒精及碘酒；羊毛脂；石蠟油；活卡價苗（BCG）（75mg／ml）；弗氏不完全佐劑（FIA）制備：稱羊毛脂10克，逐滴加入優質石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中（每瓶10ml），高壓滅菌（8磅20分鐘）後保存備用。弗氏完全佐劑乳化抗原（FCA-IgG）的制備：将FIA予溫（60℃30分鐘），吸取3ml于研缽中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及純化人IgG2.5ml（2.4mg／ml）_滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上不散開為合格。方法:一、免疫方法：根據抗原的性質不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。（1）用剪刀剪去家兔兩後腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚；（2）第一次免疫:用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA-IgG）液1ml，每側腳掌皮下各注入0.5ml。（3）第二次免疫：間隔10-14天後，于兩側窩及鼠蹊部腫大的淋巴結内注入FCA-IgG，每個淋巴結注0.1ml，其餘注入淋巴結附近皮下共1ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側窩及鼠蹊部皮下。（4）間隔7-10天後，從耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價（即試血）。效價至少應達到1∶16以上時才能放血。（5）若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈内注射免疫。即于1周内注射3次，分别為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價達到要求應立即放血。另外,也可在第2次免疫後，以弗氏不完全佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡稱FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測抗體效價，如效價達到要求立即放血。二、放血：（一）心髒采用血法（1）家兔仰面，四肢縛于動物固定架上（或由助手抓住四肢固定）；（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮膚；（3）用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心髒，并使心髒固定于左胸側位置。然後，以左拇指觸摸心髒搏動最強的部位；（4）用50ml注射器（連接16号針頭），傾針45°角度，對準心搏最強處刺入心髒抽血緻死；（5）将抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固後分離血清。（二）頸動脈放血法（1）家兔仰卧同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚；（2）沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突肌；（3）分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區疏松組織，暴露出頸總動脈後使之遊離；（4）于動脈下套入兩根黑絲線，分别置于遠心及近心端。結紮遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住；（5）用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的絲線結紮固定于放血管上，以防放血管滑脫；（6）松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一隻家兔可放血80～100ml。三、分離血清：将三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時，再置4℃冰箱内3～4小時。待血液凝固血塊收縮後，用毛細滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘，取上清加入防腐劑（0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉，最終濃度），分裝後置4℃冰箱中保存備用。結果鑒定：以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價，并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質量，應産生單一的沉澱弧線。鑒定方法的具體步驟參見有關部分。注意事項：1.免疫用實驗動物的抗體反應性個體差異性較大，因此免疫時至少應選用兩隻以上動物。另外，不能使用妊娠動物。2.免疫用的抗原必須經FCA或FIA充分乳化後才能注射，否則将明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費時、費力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是将抗原液與佐劑按比例混合後，置于混合器上使之劇烈振蕩（頻率2900轉／分，振幅6mm）；後者是将免疫用的佐劑和抗原液按比例混合後，吸入注射器内再将注射器連接于三腔管上反複抽吸研磨。這兩種方法約1小時即可使抗原充分乳化。3.佐劑一方面可提高特異性免疫反應的效果獲得高效價的免疫血清，但若抗原不純時，可使抗原中極微量的污染物（0.005mgN）産生抗體，以緻導緻免疫血清的純度受到影響。另外，有些實驗動物種系對BCG過敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當再次注射完全佐劑時,可以引起變态反應而導緻免疫失敗。為此，第二次免疫注射時應減少佐劑中BCG的含量或改用不完全佐劑，以減少和防止變态反應的發生。

　　4.抗原的劑量決定于抗原的種類。對免疫原性強的抗原劑量應相别較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對較多。抗原的用量一般以體重計算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mg／kg體重為宜。如不加佐劑時劑量可加大10倍。另外，免疫周期長者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。5.免疫方法上也可采用多點注射法免疫動物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射，同時于兩側肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一處。每點注0.2ml，間隔2周後再于上述部位選不同點同上注射，也可産生高效價的免疫血清。

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