含有芳香側鍊的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）具有強烈的紫外吸收能力。因此，蛋白與肽的濃度和其芳香族氨基酸含量與紫外吸光度是成比例的。一旦确定了給定蛋白的吸光度（氨基酸已确定），其蛋白濃度可以通過吸光度來确定。

紫外吸收法用于蛋白濃度檢測時，最低濃度可達0.1mg/mL，但是對于成分複雜的蛋白溶液（比如細胞裂解物），用紫外吸收就很難估計它們的濃度，因為溶液中組成複雜，具有吸光系數不同的蛋白，除此之外溶液中的核酸也會影響結果。然而，對于絕大多數實驗室條件下，用于科研的水溶性蛋白，測量其在280nm吸光度即可最大限度減少其他化合物的幹擾。

蛋白和肽在280nm吸光度主要受色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的影響，上文提到的苯丙氨酸隻在較低波長（240-265nm）下吸收。

吸光度和摩爾消光系數

透射光強度為P，入射光強度為P0，透光率為T

T=P/P0

吸光度A，是透光率倒數的對數

A = log (1/T)

在入射光為平行單色光且垂直照射條件下，特定的波長(λ)下樣本的吸光度和物質的摩爾濃度（c），光徑長（L）單位厘米，摩爾吸收率(ε)有關：

Aλ = εcL

比爾定律指出摩爾吸光系數是恒定的（吸光度A和濃度成正比），對于溶解在給定溶質中并在給定波長下測量的給定物質，摩爾吸收率可以稱為摩爾吸光系數或摩爾消光系數。又因為透光率和吸光度是沒有單位的，所以摩爾消光系數(ε)的單位必須和濃度（c）和光徑（L）的單位消除。因此，摩爾消光系數(ε)的單位為M-1 cm-1。因為實驗室标準分光光度計比色皿寬通常為1cm，因此，我們通常假定光徑為1cm，大多數計算中就不用考慮光徑。

Aλ = ε c L= ε c（L=1cm）

肽或蛋白質在280nm的摩爾吸光系數ε與其色氨酸（W），酪氨酸（Y）和半胱氨酸（C）氨基酸組成有關，該值和這三種氨基酸在280nm處消光系數的加權有關。

ε = (nW×5500) (nY×1490) (nC×125)

其中n是每個殘基的數目，5500、1490、125為280nm處氨基酸摩爾吸光系數。

通過吸光度來确定蛋白摩爾濃度

根據比爾定律c = A / ε L= A / ε（L = 1 cm）

我們可以通過用測得的吸光度除以該蛋白的消光系數來獲得蛋白摩爾濃，所以必須要知道該蛋白的組成成分并用上一個公式來計算其消光系數。

通過對文獻閱讀發現，對于像肽或蛋白質這樣的複雜分子，沒有單一的穩定的消光系數，緩沖液類型，離子強度和pH值的微小差異至少會略微影響吸光率，大多數蛋白質制劑，即使是純度相同的蛋白質制劑，在構象和蛋白修飾略有不同，例如氧化等等這些都會影響吸光率。因此，确定消光系數最好是通過溶解在與樣品相同的緩沖液中的已知濃度的蛋白來确定。

或者可以通過文獻查找例如Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology中彙編了許多文獻中報道過的蛋白消光系數。這些數據對于大多數常規實驗室估算蛋白濃度來說已足夠準确。報告中大多數蛋白的消光系數大多數是在280nm左右的磷酸緩沖液測得的。

1%溶液的摩爾消光系數和吸光度

我們可以運用摩爾消光系數利用公式得到樣品摩爾濃度

A / εmolar =摩爾濃度

但許多文章并不直接提供摩爾消光系數，而是以1%（1g/100mL）溶液在1cm比色皿中280nm吸光度來代替。該值可理解為百分比溶液消光系數（εpercent）這也使得消光系數ε的單位從M-1cm-1 變為(g/100mL)-1 cm-1，将其帶入公式中，得到的c就是溶液的百分比濃度（1%=1g/100mL=10mg/mL）。

即A /εpercent=百分比濃度（%）

若想将百分比濃度換算為mg/ml，就需要将百分比溶液消光系數乘以10。

即（A /εpercent）*10=濃度（mg/mL）

所以摩爾消光系數εmolar 和百分比溶液消光系數εpercent的換算關系為

εmolar*10=εpercent×蛋白分子質量（MWprotein）

例如想要确定用于蛋白質的具有具有摩爾消光系數43,824M-1 cm-1和分子量（MW）為66,400道爾頓（Da）的百分比溶液消光系數，帶入上式進行換算可得：

εpercent=（εmolar *10）/（MWprotein）

εpercent=（43,824 *10）/（66,400Da）

εpercent=6.6g/100mL

綜上所述，A280法可用于某些蛋白的濃度快速測定，但是需要明确蛋白類型以确定相關參數。

更多精彩资讯请关注tft每日頭條，我们将持续为您更新最新资讯!