一、革蘭氏染色液成分及原理

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒别染色法。未經染色之細菌，由于其與周圍環境折光率差别甚小，故在顯微鏡下極難觀察。染色後細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形态、排列及某些結構特征，而用以分類鑒定。

革蘭氏陽性菌的細胞壁主要有90%的肽聚糖和10%的磷壁酸組成，幾乎不含類脂質，厚度20-80nm。革蘭氏陰性菌的細胞壁主要由肽聚糖、脂多糖構成，厚度約10-15nm。結晶紫初染和碘液媒染後，在菌體内形成了不溶于水的大分子複合物，在使用乙醇脫色時，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，失水網孔縮小，把結晶紫與碘複合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；革蘭氏陰性菌其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘複合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料複染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

二、操作步驟

1.塗片：在載玻片上滴少量純化水，用接種環挑取少量菌苔塗開，自然幹燥或微熱幹燥，再經火焰2-3次固定。

2.初染：加（結晶紫溶液）溶液A染1分鐘，用清水沖去染液。

3.媒染：加（碘液）溶液B染1分鐘，水洗。

4.脫色：加（95%乙醇）溶液C，不時搖動玻片約10-30秒，至無紫色脫落為止，水洗。

5.複染：加（沙黃複染液）溶液D，染1分鐘，水洗。

6.觀察：用濾紙吸水晾幹後油鏡鏡檢。陽性菌呈紫色、陰性菌呈紅色。

三、注意事項

（1）塗片時挑取菌量不宜過多，塗片不宜過厚，否則可能導緻染色不完全或脫色不完全。

（2）脫色是革蘭氏染色操作中至關重要的一步，脫色時間要把握準确。脫色過度易導緻革蘭氏陽性菌染成紅色，脫色不足易導緻革蘭氏陰性菌染成紫色。

（3）革蘭氏染色宜選用細菌新鮮培養物。一些革蘭氏陽性菌在培養時間過長後易出現老化現象，細胞壁發生改變，導緻染色結果發生變化。

（4）并不是所有革蘭氏陽性菌都會染成紫色，革蘭氏陰性菌都會染成紅色。一些細菌的細胞壁構成比較特殊或易發生改變，染色時會觀察到相反的結果。

四、染色結果觀察

（1）大腸埃希氏菌O157和普通大腸埃希氏菌、沙門氏菌為革蘭氏陰菌，鏡檢形态為紅色短杆菌。

（2）志賀氏菌為革蘭氏陰性短杆菌

（3）産氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性梭杆菌，有時可見菌體内膨大不着色的芽孢結構；單增李斯特氏菌為革蘭氏陽性無芽孢短杆菌；蠟樣芽胞杆菌為革蘭氏陽性芽孢長杆菌，常呈鍊狀排列，菌體内或外有時可見不着色的橢圓形芽孢。

（4）金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，常呈葡萄狀堆積排列；副溶血性弧菌為革蘭氏陰性杆菌，菌體略有彎曲呈弧狀；唐菖蒲伯克霍爾德氏菌氏菌為革蘭氏陰性杆菌。

（5）普通變形杆菌、奇異變形杆菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌為革蘭氏陰性杆菌。

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