體内組織細胞在體外培養時,所需培養環境基本相似,但由于物種、個體遺傳背 景及所處發育階段等的不同,各自要求條件有一定差别,所采取的培養技術措施 亦不盡相同,現介紹個别組織細胞培養的要點如下:第一節 上皮細胞培養
上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于 上皮組織,故上皮細胞培養特别受到重視。但上皮細胞培養中常混雜有成纖維細 胞,培養時生長速度往往超過上皮細胞,并難以純化,同時上皮細胞難以在體外 長期生存,因此純化和延長生存時間是培養關鍵。 體内上皮細胞生長在膠原構成的基膜, 因此培養在有膠原的底物上可能利于生長, 另外人或小鼠表皮細胞培養在以 3T3 細胞為飼養層(用射線照射後)時,細胞易 生長并可發生一定程度的分化現象。降低 PH、Ca2 含量和溫度,向培養基中加 入表皮生長因子,均有利于表皮細胞生長。 以表皮細胞為例, 用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞, 其法如下 (黑 木凳志夫 1981)
1、 取材: 外科植皮或手術殘餘皮膚小塊, 早産流産兒皮膚更好, 取角化層薄者, 切成 0.5-1 平方厘米小塊。
2、置 0.02%EDTA 中,室溫,5 分鐘。
3、換入 0.25%胰蛋白酶中,4℃過夜。
4、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子将表皮與真皮層分開。
5、取出表皮,剪成更小的塊後,置 0.25%胰酶中,37℃,30—60 分鐘。
6、反複吹打,制成懸液。
7、培養:用 80 目不鏽鋼紗網濾過後,低速離心,吸去上清。
8、直接加入培養基(Eagle 加 20%小牛血清)制成細胞懸液,接種入培養瓶,CO2 溫箱培養。
第二節 内皮細胞培養
内皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞,對于研究内皮細胞再生、腫瘤促血 管生長因子(TAF)等有很大價值。 研究人内皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便,其法如下:
1、産後新鮮臍帶,無菌剪取 10—15 厘米長一段,如不能立即培養,可于 12 小 時内保存于 4℃。
2、用三通注射器吸取溫 PBS 液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩紮緊, 以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為 0.1%的粗制 膠原酶,充滿血管,消化 3—10 分鐘;注入口用線繩紮,以防液體返流。
4、吸出含有内皮細胞的消化液,于離心管中,注入溫 PBS 輕輕反複沖洗後,一 并注入離心管中(此步驟可重複) 。5、離心去上清,加入 RPMI1640 培養液制成細胞懸液,接種入培養器皿中,置溫 箱培養。兩至三天可見細胞長成單層。第三節 神經細胞培養
神經細胞(神經元)不易培養,隻有在适宜情況下,如接種在膠原底層上,或加 入神經生長因子和膠質細胞因子時,可出現一定程度的分化,長出突起等現象, 但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。 人、鼠等腦組織即可用于神經膠質細胞培養,不僅能獲得生長的膠質細胞,也可 形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來,膠質細胞在培養中生長不穩定,不易自 發轉化, 但對外界因素仍保持很好的敏感性, 可用 ROUS 病毒和 SV4 等誘發轉化。 設備: 無菌操作設備。
一、設備 培養箱:恒溫 5%、10%CO2 維持培養液中 pH 值。
二、大型設備 CO2 培養箱 倒置顯微鏡:用于每天觀察貼壁細胞生長情況。 解剖顯微鏡,用于準确地取材。 常溫冰箱:-4℃,用于保存各種培養液,解剖液和鼠尾膠。 低溫冰箱:-20℃--80℃,用于儲存血清酶,貴重物品和試劑。 電熱幹烤箱:用于消毒玻璃器皿。 高壓消毒鍋:用于消毒培養皿,手術器械。 過濾器:配制解剖液、培養液,必須過濾後才可使用,以去除細菌。 滲透壓儀,pH 劑,天平等。
三、培養器皿及手術器械 1、培養皿:常用 35mm 塑料及玻璃皿,解剖取材用 15mm-90mm 直徑。 2、培養闆,24-40 孔,可用于開放培養。 3、培養瓶: 4、吸管,常用 1,5,10ml,均需泡酸、洗滌、滅菌後方可使用。 5、各類培養液貯存器。 6、小型手術器械。
準備:
一、配制培養液 解剖液: (1)解剖液:以無機鹽(去除 Ca2 , Mg2 )加葡萄糖配制成 PBS 緩沖液,保 持一定的滲透壓和 pH 值。 基礎培養基(MEM) :主要為多種氨基酸,加入葡萄糖,雙蒸餾水溶解。 (2)基礎培養基(MEM) : 接種培養液: (3)接種培養液:用于胰酶消化後的細胞分散,做成細胞懸液,其成分為 MEM 含 1%谷氨酰胺,另加入 10%馬血清,當天配制。 維持培養液:接種後 24h,全部換成此液,後每 2 周換一次,每次換 1/2。 (4)維持培養液 其成分為 MEM 中含 5%馬血清,1%谷氨酰胺,及适量的支持性營養物質。
二、培養基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠,多聚賴氨酸,再塗膠 消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗 2-3d,達兩次 ddH2O,每遍 三、消毒培養皿的備用 洗刷 3-4 次,加塞包裝,置于烤箱中幹燥消毒,于培養前 1 天進行。 神經細胞分散培養
(一)選材 常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡 6-8d,新生鼠或胎 鼠(12-14d)或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以 19d 為宜, 小鼠以 18d 為宜,大鼠紋狀體以 10d 為宜;若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚, 則黑質以 13d,紋狀體 18-21d 為宜;小腦以 20-21d 小鼠胚胎,所獲蒲氏細胞成活率高,顆粒細胞正在分化;脊髓與 DRG 聯合培養,常用 4-7d 雞胚或 12-14d 小鼠胚胎,取材易,神經成活率高。
(二)取材。腦則取出相應組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固 定于瓊脂闆上,用小刀将其要成背腹兩側,分别培養。
(三)細胞分離與接種 細胞分離與接種。神經組織用 0.125-0.25%胰蛋白酶在 37℃孵育 30min, 移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細口吸管吹打細胞懸液,使其充 分分散,如此多次,待沉澱後吸出上層細胞懸液,計數,預置細胞密度,接種于 培養皿(1×106) ,做電生理應為 5×105 或更低。
(四)抑制膠質細胞生長 或 5-FU 抑制神經膠質細胞的生長。 抑制膠質細胞生長。培養 3-5d 後,也有人認為培養 7d 後,用阿糖胞苷。
(五)觀察。接種 6-12h,開始貼壁,并有集合現象,細胞生長突起明顯,5-7d 膠質細胞增生明顯,7-10d 膠質細胞成片于神經細胞下面,形成地毯,2 周時神 經細胞生長最豐滿,四周暈光明顯,一個月後,有些神經細胞開始退化,變形, 甚至出現空泡,一般培養 2-4 周最宜。 但神經細胞隻能增大,而不能增殖,隻能原代,不能傳代,不會有細胞周期,而 且随培養時間的延長, 細胞數量在下降, 但膠質細胞可以, 神經膠質細胞也可以。 在培養過程中,早期 9-12d 時,有較多的神經細胞死亡,這是第一次死亡階段, 應注意保持條件的恒定。在此之後存活下去的細胞一般突起長而多,且相互形成 突觸。 常用培養細胞實驗有:
(六)常用培養細胞實驗有:FCM 的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析; 免疫組化分析; 但免疫組化分析應注意,由于抗體直接作用于活細胞,不易穿透活細胞,故對核 内抗原定位時,首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性 或采用冰凍方法解決。 在免疫組化中,或其它組織學染色中,常用不同的染色方法以區分不同細胞,如 半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞标記明顯;GFAP 對星形膠質細胞具有特異性染 色等。這對研究神經系統中膠質細胞功能具有極大的應用價值。神經膠質細胞以 往多被忽視,其在腦血管疾病(如缺血性損傷) 、退行性疾病(如 AD、PD) 、損 傷後膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。 它也是神經細胞功能和營養支持的 物質基礎。第四節 肌組織細胞培養
各種肌組織均可用于培養,以心肌和骨骼肌較實用。
(一)骨骼肌細胞培養
1、出生 1 一 2 天的乳鼠,引頸處死。
2、無菌取大腿肌組織,切成 0.3 一 0.5cm2 小塊後,用不含鈣鎂離子的 Hanks 液配的 0.25%胰蛋白酶消化,無菌紗網或紗布濾過。
3、計數調整細胞密度。
4、快接種量 2×106/皿入培養基培養。
5、培養基内含 10%小牛血清,可加 1%的胎汁以促進分化。 接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化,明膠配置:用 Hanks 液配成 0.01% 明膠。 該細胞接種率約 50%,細胞生長開始呈紡錘形,培養 50-52 小時後出現融合形 成肌細胞狀多核纖維。數日後融合停止,此時可觀察到橫紋,一般在融合後二、三天内能見到收縮現象。
(二)心肌細胞培養
心肌細胞是最早的培養材料,Carrel 曾長期培養過心肌組織,至今心肌仍不失 為好的培養物,最常用的是雞胚心肌。 心肌比較容易培養和生長,可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法,均可獲良 好的效果。取心室肌培養較好,原代培養的雞胚心肌呈紡錘形,培養成功時,一 周後可見節律性收縮現象。第五節 巨噬細胞培養
巨噬細胞屬免疫細胞,有多種功能,是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的 重要對象。巨噬細胞容易獲得,便于培養,并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細 胞群,在條件适宜下可生活 2-3 周,多用做原代培養,難以長期生存。 巨噬細胞也建有無限細胞系,大多來自小鼠,如 P331、S774A.1、RAW309Cr.l 等,均獲惡性,培養中呈巨噬細胞形态和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難 以建株。 培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞, 以小鼠腹腔取材法最為實用, 其法如下: 1、實驗前三天,向小鼠腹腔内注入無菌硫羟乙酸肉湯 lml(勿注入腸内!,以 ) 刺流産生大量的巨噬細胞。 2、引頸處死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入 70%乙醇中 3-5 秒。 4、置動物于解剖台,用針頭固定四肢,持鑷撕開腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁, 把皮膚拉向上下兩側,暴露出腹膜壁。 5、用 70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸 10ml Eagle 液注入腹腔中,同時用手指從 兩側壓揉腹膜壁,使液體在腹腔内流動。 6、 用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側. 使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管内。 7、小心拔出針頭,把液體注入離心管。 8、4℃下 250g 離心 10 分鐘後,去上清,加 10ml Eagle 培養基。 9、計數細胞。每隻鼠可産生 20 一 30×106 細胞,其中 90%為巨噬細胞。 10、以 3×105 個貼附細胞/平方厘米接種。 11、接種數小時後,除去培養液,可去除其它白細胞,純化培養細胞,用 Eagle 液沖洗 1 一 2 次,再加新 Eagle 培養液置 CO2 溫箱中。
第六節 腎小球分離、移植培養
SD 大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡 1~2 分鐘,2 次,置超淨台内,打開腹腔 取出腎髒剪碎,置含 Hank's 液的無菌培養皿洗滌,置 80 目不鏽鋼篩網上。用扁 平自制小鏟輕輕碾磨産物微小組織透過篩網,濾過組織 Hank's 液混合物用吸管 吸至 120 目不鏽鋼篩網,濾過,去小組織塊,濾過物吸至 200 目不鏽鋼篩網,輕 輕濾過, Hank's 液洗滌 1 次, 收集網上腎小球, 鏡下觀察為分離良好的腎小球。 腎小球用 0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化 20 分鐘,加血清終止胰酶反應,離 心除去膠原酶。處理過的腎小球計數後接種至 24 孔培養闆或 25ml 培養瓶,使腎 小球大于 60 個/cm2,加培養基 5~10ml(培養基組成:F12—3T3 上清 1:1;5% 馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素 5μg/ml;25ng/ml 氫化可的松;5μg/ml 轉鐵 蛋白;25ng/ml 前列腺素 E1;甲狀腺素 0.02ng/ml;D-缬氨酸 150ng/ml)腎小球培養 8~10 天,去除腎小球未生長組分,細胞繼續培養 24 小時,形态學觀察: 細胞生長成單層多角型細胞,直徑約 100μm。第七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養
無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成 1mm3 小塊,用 0.5%膠原酶室溫消化 30 分鐘到 1 小時,再加等體積 0.2%胰酶消化 5~8 分鐘,在消化過程中用吸管吹打 組織塊或用自制裝置 (分别作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接 而成,濾器中間墊兩層絲質材料以隔斷組織塊與單細胞)來回推動注射器吹打組 織以分離單細胞,終止酶消化方法同上。 常規方法接種培養收獲細胞。
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