【實驗原理】

将适量目的抗原經合适途徑注射動物，刺激動物發生免疫應答，産生特異性抗體。抗體存在于血清中，含有目的抗體的血清稱為免疫血清。高效價、高特異性的免疫血清可作為免疫學診斷的試劑（如用于制備免疫标記抗體等），也可供特異性免疫治療用。免疫血清的制備是一項常用的免疫學實驗技術。制備方法因抗原的性質不同而異，下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。

【材料與儀器】

1. 健康成年家兔，雄性，體重2～3kg。

2. 滅菌生理鹽水、純化人IgG（10mg／ml）、消毒酒精及碘酒、羊毛脂、石蠟油、活卡介苗（BCG）（75mg／ml）。

3.剪刀及鑷子、注射器（2ml、50ml）、稱量瓶（10ml）、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶（200ml）、手術器械一套、血管夾、黑絲線及塑料放血管、研缽。

【實驗方法】

（一）抗原及佐劑的制備

1. 弗氏不完全佐劑（FIA）的制備：稱羊毛脂10g，逐滴加入優質石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝于疫苗瓶中（每瓶10ml），高壓滅菌（55.21kPa20min）後保存備用。2.弗氏完全佐劑乳化抗原（FCA－IgG）的制備：将FIA預溫（60℃30min），吸取3ml于研缽中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及純化人IgG（2.4mg／ml）2.5ml，邊滴入邊研磨，直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴于冷水面上，以不散開為合格。

（二）免疫動物

1. 用剪刀剪去家兔兩後腳掌的部分兔毛，用酒精及碘酒消毒皮膚。

2. 第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）（簡稱FCA－IgG）液1ml，每側腳掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：間隔10～14天後，于兩側腘窩及足蹊部腫大的淋巴結内注入FCA－IgG，每個淋巴結注0.1ml，其餘注入淋巴結附近皮下共1ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩側腘窩及足蹊部皮下。

4.間隔7～10天後，從耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體效價（即試血）。效價至少應達到1∶16以上時才能放血。

5.若效價未達到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈内注射免疫。于1周内注射3次，分别為0.1、0.3、0.5ml，間隔1周再試血。如效價達到要求應立即放血。另外，也可在第二次免疫後，用弗氏不完全佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡稱FIA－IgG）再免疫1～2次注射部位、劑量和間隔時間均同第二次，再試血測抗體效價，如效價達到要求立即放血。

（三）分離血清

1. 心髒采血法

（1）家兔仰卧，四肢縛于動物固定架上（或由助手抓住四肢固定）。

（2）剪去左胸部兔毛，消毒皮膚。

（3）用左拇指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心髒，并使心髒固定于左胸側位置。然後，以左拇指觸摸心髒搏動最強的部位。

（4）用50ml注射器（連接16号針頭），針傾斜45°角，對準心搏最強處刺入心髒抽血緻死。

（5）将抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中。

（6）将三角燒瓶内的血置37℃溫箱1h，再置4℃冰箱内3～4h。

（7）待血液凝固血塊收縮後，用毛細滴管吸取血清。

（8）3000r／min離心15min，取上清加入防腐劑終濃度（0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉），分裝後置4℃冰箱中保存備用。

2. 頸動脈放血法

（1）家兔仰卧同上固定。頭部略放低以暴露頸部，剃毛及消毒皮膚。

（2）沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突肌。分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區疏松組織，暴露出頸總動脈後使之遊離。

（3）于動脈下套入兩根黑絲線，分别置于遠心及近心端。結紮遠心端的絲線，近心端的動脈用血管夾夾住。

（4）用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動脈壁上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的絲線結紮固定于放血管上，以防放血管滑脫。

（5）松開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一隻家兔可放血80～100ml。

（6）将三角燒瓶的血置37℃溫箱中1h，再置4℃冰箱内3～4h。

（7）待血液凝固血塊收縮後，用毛細滴管吸取血清。

（8）3000r／min離心15min，取上清加入防腐劑（終濃度，0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉），分裝後置4℃冰箱中保存備用。以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體效價，并用瓊脂免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質量，應産生單一的沉澱弧線。鑒定方法的具體步驟參見有關部分。

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