掃描電鏡對于樣品具有一定的要求：

樣品要盡可能幹燥，若樣品中含有水份，水分揮發會造成倉内真空度急劇下降，導緻圖像漂移，有白色條紋，甚至會影響燈絲壽命；

熱穩定性好，熱穩定性差的樣品往往在電子束的轟擊下分解，釋放氣體和其他物質，污染電鏡；

導電性好，導電性差的樣品會發生荷電效應，造成圖像畸變，亮點亮線，像散等；

不含強磁性，強磁性的樣品觀察一般會出現嚴重的像散，無法消去，磁性粉末如果粘的不牢固還可能會吸附到探頭上，損害電鏡。

生物樣品具有含水量高、質地柔軟、導電性差、容易變形等特點，因此采用掃描電鏡觀察生物樣品時，必須對樣品進行必要的處理。

生物樣品通常指的是動物的體液、肌肉、毛發和一些組織器官，植物的根、莖、葉、果實等，以及各類微生物（細菌、真菌等）。生物樣品的含水量高，一般為70%-80%，隻有少數的樣品，如一些花粉、毛發等可以直接放入掃描電鏡中觀察，大部分生物樣品需要經過脫水幹燥處理後才能進行觀察。

生物樣品制備的關鍵步驟是幹燥，應盡量減少因水分蒸發導緻的形變。大多數動植物， 特别是柔軟的細胞和組織，在幹燥時由于體積應力和表面張力的作用，容易發生明顯的塌陷和變形，造成形貌失真。

肖媛等人通過查閱大量的文獻，比較了各類幹燥方法在掃描電鏡生物制樣過程中的優缺點，歸納總結了微生物、植物和動物樣品幹燥方法的一般性選擇原則，如下表所示 [1]。

下面，我們就對目前被公認幹燥效果最好的臨界點幹燥法進行詳細介紹。

表1： 五種常用生物樣品幹燥方法比較

生物樣品制備的基本流程如下：

取材：

一般使用鋒利的刀片将樣品切成5mm見方，高度3mm左右，在滿足觀察條件的前提下，樣品小一些更好，一方面臨界點幹燥儀的樣品倉較小，另一方面，小的樣品尺寸固定液更容易滲透到樣品内部，固定效果更好。取材完成後，先進行清洗（超聲清洗3-5min），再迅速地放置到固定液中，放置樣品脫水皺縮。

固定：

臨界點幹燥法前處理常用的固定劑有戊二醛和四氧化锇。

戊二醛是一種五碳醛，一般配制濃度為1-4%，常用濃度為2.5%（PH7.2-7.4）。一般市場上所售賣的戊二醛濃度為25%，使用前需要對其稀釋。溫度較高或者堿性條件下，戊二醛容易發生聚合失去醛基，降低交聯能力，因此，我們一般使用0.1M的磷酸緩沖液作為溶劑稀釋戊二醛，并在4°C下保存。

特别注意，戊二醛對皮膚有硬化作用，皮膚粘上會變黃，難以洗掉，所以使用時一定要帶手套。

它的反應速度快，是優良的前固定劑。用戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以進行長時間固定（但最好不要超過一個星期），因而适用于遠離實驗室或野外現場取材。但戊二醛對于含脂類較多的樣品固定效果不佳，如細胞膜。

四氧化锇是一種很強的氧化劑，一般配制濃度為0.5-2.0%，常用濃度為0.5-1.0%（PH7.2-7.4）。它具有很強的毒性，四氧化锇氣體對呼吸系統有刺激，對眼睛有嚴重的破壞作用，因此在使用時應特别小心，盡可能在通風櫥中進行，并且嚴格控制用量。但它作為固定劑擁有一些獨特的優點：

四氧化锇可以與、和蛋白質。其對的固定作用可以補充醛類固定劑對脂類固定不足的缺點。

用固定材料時，被還原的锇能沉積在樣品表面上，能增加的，起到""作用，往往結構比較清晰。

因此，含脂類物質比較少的生物樣品（如植物類），采用戊二醛固定，将采取的樣品泡入2.5%的戊二醛溶液中浸泡超過4 h即可。對于含脂類物質較多的樣品（如細胞膜），我們采用戊二醛和四氧化锇雙重固定，先在2.5%的戊二醛溶液中浸泡3 h以上，再浸泡在1%的四氧化锇1h。

漂洗：

用0.1M的磷酸緩沖液（PBS）沖洗4次，每次20 min，洗淨固定液。

脫水：

配置濃度分别為30%，50%，70%，90%，100%的酒精，用不同濃度的酒精溶液逐級脫水，從低濃度到高濃度（30%2次，50%2次，70%1次，90%1次，100%兩次）浸泡1-2次，每次10min。

置換：

将脫水後的樣品浸泡在醋酸異戊酯溶液中15min左右，醋酸異戊酯的極性較低，臨界點幹燥時，能夠更好地與二氧化碳置換，幹燥效果更好。

幹燥：

我們采用二氧化碳臨界點幹燥儀進行幹燥。此方法是根據物質處在臨界點時的特殊物理狀态設計的一種幹燥方法。在臨界狀态下，液體和氣體的密度相等，氣液界面完全消失，液體的表面張力系數為零。簡單來說就是，通過消除樣品表面張力、使得樣品在不受表面張力損傷的條件下幹燥。

經過以上步驟，我們就能得到飽滿的不皺縮的生物樣品了。接着使用飛納台式掃描電鏡分析樣品，下圖分别為自然幹燥的小鼠氣管内絨毛（左圖）和臨界點幹燥的氣管内絨毛（右圖）。左圖的内絨毛已經完全塌陷在一塊，主要是由于絨毛在自然脫水過程中受到表面張力的作用而收縮。而右圖的絨毛是采用二氧化碳臨界點幹燥，通過消除樣品的表面張力，使得樣品在脫水過程能夠保持原始形貌。

自然幹燥的氣管内壁

臨界點幹燥的氣管内壁

快來按照本文介紹的經驗，制備您的生物樣品，用掃描電鏡觀察吧。

參考文獻：

[1] 肖媛, 劉偉, 汪豔, 等. 生物樣品的掃描電鏡制樣幹燥方法[J]. 實驗室研究與探索, 2013, 32(5): 45-53.

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