pcr退火操作?大家在做 PCR 實驗的過程中，有沒有遇到一些奇奇怪怪的問題？我們經常會收到一些老師們的咨詢，為了能統一給大家參考，小卓特地給大家整理一篇，挑出幾個有針對性的問題，統一進行解答，接下來我們就來聊聊關于pcr退火操作?以下内容大家不妨參考一二希望能幫到您!

pcr退火操作

大家在做 PCR 實驗的過程中，有沒有遇到一些奇奇怪怪的問題？我們經常會收到一些老師們的咨詢，為了能統一給大家參考，小卓特地給大家整理一篇，挑出幾個有針對性的問題，統一進行解答。

01、隻有熔解曲線，沒有擴增曲線？

可能是在 PCR 循環時沒有設置采集熒光的步驟，而熔解曲線默認采集熒光，所以最後結果隻有熔解曲線，沒有擴增曲線。

TIPS：在 set up 的 run methods 裡，如果把 40 個擴增時 60 度 1 分鐘後下面的小方框單擊去掉，這時就不會采集熒光信号了。按理說後面的溶解曲線也不會出現，隻能在 multiple component 那裡才能看到。

02、部分擴增曲線向下彎曲

可能是基線終止循環設置不正确，可以手動設置基線，重新分析即可。

TIPS：在 analysis 選項裡，可以将基線的 auto 設置前的勾去掉，則可以對基線進行手動設置。拉動 x 軸下方的小三角形，往 ct 值大的方向拉動，重新 analysis，然後選擇線性圖，可以看到擴增曲線會變形。或者可以在 analysis settings 中，手動修改基線的起始和終止循環。

03、高濃度 ROX 校正，擴增曲線呈鋸齒狀斷裂

可能是試劑中的參比熒光染料 ROX 濃度與儀器機型不匹配導緻的 Badrox，往往出現在需要高濃度 ROX 校正的 ABI 7900HT、StepOne 等儀器上。

可在「Setup」中進行設置，将「Passive Reference」的「ROX」調整為「None」，擴增曲線即恢複正常。曲線恢複正常後，該數據能夠采用需根據複孔重複性進一步判斷。

04、擴增曲線不是标準的 S 形

探針質量不好，比如部分降解會幹擾基線且使得 PCR 效率不高；試劑質量不好也會出現 PCR 效率不高等問題。這些情況都會使得擴增曲線異常，不是标準的 s 形。

05、熔解曲線有些孔是單峰，有些是雙峰

如果熔解曲線出現雙峰，證明擴增産物中有兩種産物，可能是引物二聚體或非特異性産物。可以重新設計引物，或者優化 PCR 反應條件。

06、加樣重複樣品 Ct 值重複性不夠好

重複性不好的原因很多，大部分是因為加樣不準确。

07、标準品相關系數不佳

1.标準品濃度太低，即使是最高濃度也是标準品 Ct 值也大于 25 接近 30，低濃度的 DNA 樣品保存時間較長會有降解現象出現，因此建議将标準品濃縮。

2.标準品倍比稀釋不好，建議 10 倍比稀釋，且采用逐步倍比稀釋的辦法。比如将 10 v 的高濃度标準品 a 加入 90 v 的水中得到 10 被稀釋後的标準品 b，徹底混勻之後再吸取 10 v 的 b 加入 90 v 的水中。

08、使用默認檢測熒光 HEX 标記探針，信号會非常弱

需要通過添加 customer dye，對 HEX 進行校正。（HEX 不是 Applied Biosystems（ABI）進行過校準的熒光，所以同學們使用這類熒光标記探針時，必須使用純的熒光[即 customer dye]運行一次進行校正。）

09、擴增曲線尾部出現彎折

1.儀器長時間未校準，在檢測中出現了波動，建議定期校準儀器；

2.RNA 模闆不純，建議增大模闆稀釋倍數或者重新制備較高純度的 RNA 模闆。

10、沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題：

1.循環數不夠(一般不超過45循環,不僅背景值提高,定量也不準)；

2.PCR程序設置錯誤,檢測熒光信号的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信号,另外熒光采集是否選中；

3.引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解；

4.模闆量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可),對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發生模闆降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反複凍融的情況,建議将模闆樣本小量分裝儲備,避免反複凍融；

5.引物探針是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保擴增基因組DNA;上下遊引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

11、标準曲線不佳

标準曲線線性關系不佳R2<0.9,很有可能是以下環節存在問題：

1.标準品稀釋或者加樣誤差,使得标準品不呈梯度；

2.标準品出現降解。應避免标準品反複凍融,将高濃度DNA模闆分裝,保存于-20℃或-80℃,現配現用；

3.引物或探針不佳。重新設計更好更穩定的引物或探針；

4.模闆中存在抑制物。模闆濃度過高,根據現有商品化熒光定量試劑盒的要求,一般模闆量以50—500ng為宜。

12、ct值過晚

在相對定量中,Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中,對低拷貝數的樣品,Ct值會增大,但是一般不宜超過40循環,否則定量不準确。因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況,需要根據具體實驗設計和目的進行。

1.擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合适,需要進行優化;引物或探針設計不合理,需要重新設計；

2.PCR程序不合适,改用三步法進行反應,或者優化退火/延伸溫度,可以适當降低退火溫度;退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s)；

3.MgCl2濃度不合适,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足；

4.PCR産物太長。PCR産物設計超過500bp；

5.模闆中存在抑制物。用高純度模闆進行PCR檢測或将模闆進行稀釋。

13、熔解曲線峰不特異

熔解曲線峰不特異很有可能是以下環節存在問題:

1.引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現;引物濃度不佳,尤其是涉及二聚體存在時,适當降低引物濃度,并注意上下遊引物的濃度比例;

2.模闆有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異性擴增。

3.離子濃度不合适。适當降低鎂離子濃度,或選擇更适合的mix試劑盒,不同試劑盒在該方面的優化能力不适合,有些情況下可以通過更換試劑盒改善結果。

14、陰性對照擴增有信号

照擴增有信号排查各操作環節是否有不當,造成交叉污染：

1.引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

2.引物濃度不佳。适當降低引物濃度,并注意上下遊引物的濃度配比。

3.鎂離子濃度過高。适當降低鎂離子濃度,或選擇更适合的mix試劑盒。

4.模闆有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異性擴增。

5.交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染,或操作環境中有氣溶膠造成污染,建議對操作環境進行處理,或者更換新的環境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。

15、擴增曲線異常

遇到擴增曲線異常,比如“S”型曲線等等情況,有可能是以下環節存在問題：

1.模闆的濃度太高或者降解；

2.熒光染料的降解；

3.在操作熒光定量PCR時,帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字迹等；

4.液體揮發。耗材氣密性等問題引起液體蒸發,沒有很好的聚集在管子裡；

5.氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。

16、擴增效率低

該情況适用于針對所有的基因,特别是内參基因仍無法獲得較好的擴增信号時,應考慮如下情況:

1.反應試劑中部分成分比例是否最佳,另外考慮熒光染料是否降解；

2.反應條件不夠優化。可适當降低退火溫度或改為三步擴增法,适當延長變性退火時間；

3.反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模闆時所引入的,應先把模闆适度稀釋,再加入反應體系,減少抑制物的影響。

17、沒有擴展條帶

1.酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。

2.變性溫度是否準确：PCR 儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模闆變性不徹底。

3.反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加 Taq 酶以前，将反應體系 95℃ 加熱 5~10 分鐘。

4.引物變質失效。人工合成的引物是否正确。是否純化，或因儲存條件不當而失活。

5.引物錯誤。利用 BLAST 檢查引物特異性或重新設計引物。

6.DNA 凝膠電泳時加入陽性對照，确保不是 DNA 凝膠和 PCR 程序的問題。

7.模闆含有雜質。特别是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成 DNA 脫嘌呤而影響 PCR 的結果。

18、PCR 産物量過少

1.退火溫度不合适。以 2 度為梯度設計梯度 PCR 反應優化退火溫度。

2.DNA 模闆量太少。增加 DNA 模闆量。

3.PCR 循環數不足。增加反應循環數。

4.引物量不足。增加體系中引物含量。

5.延伸時間太短。以 1 kb/分鐘的原則設置延伸時間。

6.變性時間過長。變性時間過長會導緻 DNA 聚合酶失活。

7.DNA 模闆中存在抑制劑。确保 DNA 模闆幹淨。

19、擴增産物跑電泳條帶彌散

1.酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。

2.dNTP 濃度過高。減少 dNTP 的濃度。

3.MgCl₂ 濃度過高。可适當降低其用量。

4.模闆量過多。質粒 DNA 的用量應<50 ng，而基因組 DNA 則應<200 ng。

5.引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重複 PCR 反應。

6.循環次數過多；增加模闆量減少循環次數至 30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的 PCR 循環。

6.退火溫度過低。

7.電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒有凝固好；

③瓊脂糖質量差。

8.若為 PCR 試劑盒則可能：

①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；

②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。

9.降解的陳舊模闆擴增也易産生塗布。

20、擴展産物出現雜帶

1.引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

2.循環的次數過多。适當增加模闆的量，減少循環次數。

3.酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。

4.退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的 PCR 擴增。以 2 度為梯度設計梯度 PCR 反應優化退火溫度。

樣品處理不當。

5.Mg2 濃度偏高，因适當調整 Mg2 使用濃度。

6.若為 PCR 試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。

7.複制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

8.反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。确保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。

9.引物特異性差。利用 BLAST 檢查引物特異性或重新設計引物。

10.引物量過多。減少反應體系中引物的用量。

11.模闆量過多。質粒 DNA 的用量應<50 ng，而基因組 DNA 則應<200 ng。

12.外源 DNA 污染。确保操作的潔淨。

21、條帶大小與理論不符

1.污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作台進行清潔。

2.模闆或引物使用錯誤。更換引物和模闆。

3.基因亞型。對研究的基因進行序列分析和 BLAST 研究。

22、陰性對照出現條帶

試劑，槍頭，工作台污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作台進行清潔。

今天的知識分享就講到這裡，關于PCR實驗中的常見問題，你都了解了嗎？有任何疑問，歡迎咨詢您身邊的卓誠人，我們将不懈努力，為您提供更優質的産品和服務！

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