pcr的原理和操作要點?原位PCR在科學研究中，每一項新技術的創立都會帶來一系列新的研究成果問世，從而推動着各學科的發展縱觀形态研究領域，50年代電子顯微鏡引入形态學觀察領域，帶來了從細胞水平到亞細胞水平的深入研究；60-70年代，免疫組織化學與免疫細胞化學技術的廣泛應用，又将觀察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質分子水平，使細胞内衆多的活性物質得以進行細胞或亞細胞水平的定位，對醫學生物學的發展無疑産生了深刻的影響70年代，分子生物學技術在形态學中的廣泛應用，随着原位雜交技術的出現，使組織細胞内特定的DNA或RNA序列能夠被定位，将蛋白質水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位，從而使人類對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化；80年代，分子生物學領域中一項具有強大生命力的技術PCR——多聚酶鍊反應技術問世了，很快地就被引入形态學觀察的領域，使細胞内低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察這一技術的問世，必将帶來更多的研究成果，使形态學的研究又向前邁出一大步，我來為大家講解一下關于pcr的原理和操作要點?跟着小編一起來看一看吧!

pcr的原理和操作要點

原位PCR

在科學研究中，每一項新技術的創立都會帶來一系列新的研究成果問世，從而推動着各學科的發展。縱觀形态研究領域，50年代電子顯微鏡引入形态學觀察領域，帶來了從細胞水平到亞細胞水平的深入研究；60-70年代，免疫組織化學與免疫細胞化學技術的廣泛應用，又将觀察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質分子水平，使細胞内衆多的活性物質得以進行細胞或亞細胞水平的定位，對醫學生物學的發展無疑産生了深刻的影響。70年代，分子生物學技術在形态學中的廣泛應用，随着原位雜交技術的出現，使組織細胞内特定的DNA或RNA序列能夠被定位，将蛋白質水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位，從而使人類對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化；80年代，分子生物學領域中一項具有強大生命力的技術PCR——多聚酶鍊反應技術問世了，很快地就被引入形态學觀察的領域，使細胞内低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察。這一技術的問世，必将帶來更多的研究成果，使形态學的研究又向前邁出一大步。

1、基本原理

原位PCR技術的基本原理，就是将PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。 PCR技術是在DNA聚合酶的作用下，經過模闆的變性、退火和引物延伸三種循環，将引物引導下的特異性靶序列迅速地進行擴增，經過擴增的靶序列（一般能擴增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術具有靈敏度高，特異性強的優勢，随着熱循環自動化的提高與穩定也使得PCR技術的操作簡便易行。但是，PCR技術是在液相中進行的，在擴增前，需将細胞破壞，從中提取核酸作為模闆，因此很難将PCR的結果與組織細胞的形态結構聯系起來，同時，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。 原位PCR技術成功地将PCR技術和原位雜交技術結合起來，保持了兩項技術的優勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術的待檢标本一般先經化學固定，以保持組織細胞的良好形态結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞内或細胞核内，以固定在細胞内或細胞核内的RNA或DNA為模闆，于原位進行擴增。擴增的産物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜内外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞内單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數極擴增，擴增的産物就很容易被原位雜交技術檢查。

2 基本類型

根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标記，原位PCR技術可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉錄原位PCR技術等。

2.1直接法原位PCR技術

直接法原位PCR技術是将擴增的産物直接攜帶标記分子，即使用标記的三磷酸腺苷或引物片斷。當标本進行PCR擴增時，标記的分子就摻入到擴增的産物中，顯示标記物，就能将特定的DNA或RNA在标本（原位）中顯現出來。 常用的标記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學及免疫組織化學的方法去顯示标記物所在位置。

直接法原位PCR技術的優點是操作簡便，流程短，省時。缺點是特異性較差，易出現假陽性，擴增效率也較低，特别是在石蠟切片上，上述缺點更為突出。因為在制片過程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會導緻DNA的損害，而受損的DNA可利用反應體系中的标記三磷酸核苷進行修複，這樣标記物就會摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽性。若用标記引物的方法進行直接法原位PCR，其擴增的效率比不标記更低。

2.2 間接法原位PCR技術

間接法原位PCR技術是先在細胞内進行特定DNA或RNA擴增，再用标記的探針進行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應用最為廣泛的原位PCR技術。 間接法原位PCR與直接法不同的是，反應體系與常規PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何标記物。即實現先擴增的目的，然後用原位雜交技術去檢測細胞内已擴增的特定的DNA産物，因此，實際上是将PCR技術和原位雜交技術結合起來的一種新技術，故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。 間接法PCR技術的優點是特異性較高，擴增效率也較高。缺點是操作步驟較直接法繁瑣。

2.3 原位反轉錄PCR技術

原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是将液相的RT-PCR技術應用到組織細胞标本中的一種新技術，與RT-PCR（液相）不同點在于，進行原位反轉錄PCR反應之前，組織标本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴增的模闆是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。

3 基本步驟

原位PCR技術的基本步驟包括标本的制備。原位擴增（PCR）及原位檢測等基本環節，現分述如下（重點以石蠟切片為例）。

3.1 标本的制備

原位PCR技術可應用于細胞懸液、細胞塗片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。随着技術方面的一些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是标本經制片後，細胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴增産物易發生彌漫而導緻擴增的産物在原位不易保留。絕大多數的病理标本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關技術問題，意義顯然是十分重大的。

組織細胞的固定 一般認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定後進行原位PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長，視組織的大小，一般以4℃4-6小時為宜。

切片的厚度 一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因為切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時膜結構也較多，防止擴增産物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多，形态學觀察的效果就差了，分辨率也将下降。

玻片的處理 為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應作防脫片處理，常用的方法是塗以多聚賴氨酸或用矽烷化處理，一般能防止組織脫落。

蛋白酶的消化作用 在進行原位擴增之前，組織标本需經蛋白酶處理。經蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充分允許反應體系中的各成分進入細胞内，并能很好的暴露靶序列，以利于擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據組織固定的程度進行調整。蛋白酶消化後，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌将酶完全去除，因為隻要有少量的殘留酶存在，都将對随後進行的PCR反應體系的數量TaqDNA酶産生毀滅性的影響。

蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性，有利于後續進行的各反應成分進入細胞内或核内，但同時也使得擴增産物的彌散機會增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結果。

原位擴增（PCR）

原位擴增即在組織細胞标本上進行PCR反應，其基本原理與液相PCR完全相同。 引物 PCR所用的引物一般為15-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過400bp，RNA很少超過200bp，較長序列的擴增易引起引物與模闆的錯配而導緻非特異性反應的出現。

反應體系 原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同，由于是在經過固定的組織切片上進行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反應體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2 的濃度均應高于液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。

熱循環 原位PCR的熱循環可在專門的熱循環儀上進行，操作簡便。也可在一般的PCR熱循環儀上進行，通常在樣品台上覆蓋一層鋁箔，制成平台，樣品台上的空間用礦物油或水充填，将載玻片至于平台上，即可進行熱循環的步驟。 為了保證進行充分的擴增，原位PCR熱循環中每一步驟的時間可比常規PCR略長些，另外，也可采用熱啟動（hot start）的方法，即玻片加熱到80-94℃時，再立即加入TaqDNA聚合酶。 為了保證反應體系在熱循環過程不過多丢失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。

洗滌 原位擴增結束後，标本應清洗，以除去彌散到細胞外的擴增産物。洗滌不充分，會導緻擴增産物在檢測時顯現，造成背景過深或假陽性結果的出現。但是，洗滌過度，也會造成細胞内擴增的産物被洗脫，是陽性信号減弱或丢失。 有作者在擴增後用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鐘進行後固定，以使擴增的産物在檢測時能很好地保留在細胞内，提高檢測的敏感性和特異性。

原位檢測 原位PCR的擴增産物檢測方法，取決于原位PCR的設計方案，直接法則根據标記分子的性質對擴增産物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進行檢測。

4 原位PCR技術的應用

原位PCR技術的突出優勢，就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質，可将原位PCR的應用分為檢測外源性基因和内源性基因兩方面。

4.1用于外源性基因的檢測

4.1.1病毒基因的檢測

感染病毒的細胞常無較好的檢測手段，但當原位PCR技術應用後，使這一極為困難的問題有望解決。 對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時發現受感染的人群。

4.1.2細菌基因的檢測

最突出的應用是在結核杆菌的檢測上，當結核病變不夠典型時，經過特殊染色的方法很難在鏡下找到結核杆菌，而應用原位PCR技術可幫助明确診斷，當結核杆菌很少時仍能在鏡下被很容易地找出來。

4.1.3導入基因的檢測

在轉基因動物的研究中，是否導入了基因，在接受基因治療的患者體内，是否接受了導入的基因，均可用原位PCR技術來證實。因此，原位PCR技術成為重要的檢測手段。

4.2 用于内源性基因的檢測

4.2.1異常基因的檢測

機體内基因的突變、重排、也可用原位PCR技術進行檢測，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鍊基因的重排，對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應用前景。

4.2.2固有基因的檢測

對于機體細胞内隻有單個或幾個拷貝的低表達固有基因，原位雜交技術因基因拷貝數太少而無能為力，液相PCR雖可進行擴增檢測出來，但不能确定含有該基因的細胞類型，原位PCR技術則彌補了上述兩種技術的不足，使得我們能夠對人類各種基因進行檢測，而完成人類基因圖的繪制。

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