揭示水黴菌繁殖和侵染過程

水黴病又稱為膚黴病、白毛病，是淡水養殖動物常見緻病菌。水黴（Saprolegnia）隸屬于茸鞭生物界（Stramenopila）、鞭毛菌亞門（Mastigomycotina）、卵菌綱（Oomycetes）、水黴目（Saprolegniales）、水黴科（Sprolegniaceae），主要包括水黴屬（Saprolegnia）、綿黴屬（Achlya）、絲囊菌屬（Aphanomyces）等。水黴病常年發生，尤其是在冬春兩季。水黴病的發生主要是水黴孢子大量繁殖、魚體表受傷或免疫力下降和溫度驟變等原因共同造成（Behrens等，1994；Khulbe等，1995）。

水黴繁殖包括有性繁殖和無性繁殖，其中無性繁殖最為常見。水黴的無性繁殖是指在适當環境條件下，水黴菌絲發育為遊動孢子囊，遊動孢子囊内形成遊動孢子，遊動孢子囊頂端形成小孔，具有兩根頂生鞭毛的梨形孢子（第一型遊動孢子）逸出，經過短期遊動後，進入靜止期，後在靜體上形成一個具有兩根側生鞭毛的腎形孢子（第二型遊動孢子），再經過短時間遊動後就休止，休止孢子萌發成芽管，芽管發育成新的菌絲。

圖1 水黴無性繁殖（引自Hughes，1994；）

A：菌絲；B：孢子囊；C：遊動孢子釋放；D初生遊動孢子（第一型遊動孢子）；E-F：初生孢孢子（靜止）；G：釋放次生遊動孢子；H：次生遊動孢子（第二型遊動孢子）；I：次生孢孢子；J：孢子萌發。

水黴的有性繁殖是在條件有利有性生殖時，營養菌絲上形成較大的球狀藏卵器和較小的菌絲狀雄器。藏卵器球形或梨形，多數頂生，少數側生。藏卵器具有雄性器官，雄器短而粗與藏卵器同枝，少數異枝。減數分裂則在配子囊内發生，雄器通過受精管穿過藏卵器壁到達卵球，進行質配和核配。

受精後形成卵孢子，卵孢子分化呈中央型或亞中央型，每個藏卵器3～25個卵孢子不等，卵孢子由藏卵器壁的分解而釋出，經過3～4個月休眠後萌發産生具有短柄的遊動孢子囊或菌絲，完成整個生活史。

圖2 水黴有性生殖（引自夏文偉，2011）

A：藏卵器與雄器異枝；B: 藏卵器與雄器同枝

本實驗以水黴菌标準菌株為研究對象，通過對水黴菌落形态和繁殖過程的顯微鏡觀察，從而了解水黴菌的生長形态，水黴菌的生長繁殖過程，水黴菌孢子釋放過程等，為鑒定和預防水黴病提供參考依據。

1 .材料和方法

1.1 實驗材料

供試菌株：緻病性水黴菌保存于武漢華揚動物保健集團技術中心。實驗試劑：PDA（Potato Dextrose Agar）培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）。實驗儀器：恒溫培養箱，光學顯微鏡，電子天平，高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.2 實驗方法

将保種的水黴菌塗布于PDA培養基，28℃恒溫培養。待長出單菌落後，将單菌落接種至50ml PDA液體培養基，28℃搖床培養4-5d，制備水黴菌液，制片并在顯微鏡下觀察。将300ul水黴菌液塗布PDA平闆，28℃恒溫培養4-5d，持續觀察水黴菌落形态，待水黴菌絲長滿整個平闆後，加入10ml無菌水并輕刮表面，使水黴孢子充分融入無菌水中。将混有水黴孢子無菌水至離心管中，3000rpm離心5min，除去菌絲等雜質。制備水黴孢子液制片并顯微觀察。

2 .實驗結果與分析

2.1 水黴菌落結果與分析

通過對水黴菌落持續觀察，結果顯示，水黴菌在PDA培養基培養24h時，同一平闆不同單菌落生長快慢有差異。初始水黴菌落形态無規則，顔色較淺（圖3A）。培養48 h，水黴菌落呈放射狀生長，菌落為規則的圓形，邊緣整齊，菌絲深入到瓊脂内部，交織成網狀，生長在瓊脂外部為灰白色絮狀物（圖3B）。之後繼續培養，菌絲長滿整個培養基（圖3C）。實驗結果對水黴病防控具有一定指導意義，水黴病重在預防，一旦水黴病爆發，菌絲向内生長，會深入肌肉很難殺滅。提前預防，可以将水黴菌絲和水黴孢子殺滅在水體中，避免通過傷口感染魚體。

圖3 水黴菌落形态

A：24h水黴菌落形态；B：48h水黴菌落形态；C：72h水黴菌落形态.該實驗觀察菌落形态與圖4相似（夏文偉，2011；粱永增2016）。

圖4 水黴菌落形态（引自夏文偉，2011；粱永增，2016）

2.2 水黴顯微鏡結果與分析

水黴孢子液和水黴菌液制片在顯微鏡下觀察結果如圖5，結果顯示，孢子多為遊動，形狀為近似圓形。水黴孢子遊動，也導緻了水黴病傳染迅速。因此，水黴病一定要早發現早治療。待看到魚體表有白毛時，會釋放更多的水黴孢子到水體中，加重水黴的感染。

① A

② B

① C

② D

圖5水黴孢子

A：水黴孢子液孢子（40 x）；B: 水黴孢子液孢子（100x）；C：水黴菌液孢子（40 x）；B: 水黴菌液孢子（100 x）

該實驗觀察水黴孢子形态與圖6相似（劉榮軍，2014；韓靈莉；2017）。

圖6 水黴孢子（引自劉榮軍，2014；韓靈莉；2017）

水黴菌液顯微結果顯示，水黴菌絲為透明管狀結構，中間無橫隔，分支較少，細長。頂端為遊動孢子囊，且多呈棒狀（圖7）。

圖7 水黴菌絲與孢子囊（40x）

該實驗觀察水黴菌絲與孢子囊形态與圖8相似（許佳露， 2012）。

圖8 水黴菌絲與孢子囊（引自許佳露，2012）

孢子囊中有遊動孢子，遊動孢子呈多排排列，發育成熟後從孢子囊頂端釋放出來，并迅速遊離（圖9）。水黴病的防控需要注意，一旦看到長白毛的病魚，及時撈出，避免菌絲末端孢子囊釋放孢子到水體中感染更多的魚。

圖9水黴孢子囊釋放孢子（100x）

該實驗觀察水黴孢子囊釋放孢子過程與圖10相似（Ke等，2009；許佳露，2012；夏文偉，2011）。

圖10水黴孢子囊釋放孢子（引自Ke等，2009；許佳露，2012；夏文偉，2011）

圖11 新遊動孢子囊以内層出方式産生（40x）

該實驗觀察水黴新遊動孢子囊以内層出方式産生與圖12相似（許佳露，2012；Ke等，2009；張楠，2014）。

圖12 新遊動孢子囊以内層出方式産生（引自許佳露，2012；Ke等，2009；張楠，2014）

3. 讨論

本文揭示了水黴菌的繁殖過程是菌絲大量生長後，在菌絲的末端長出孢子囊，孢子囊一定程度後會從頂端釋放孢子，遊動孢子在水體和魚體遇到合适機會會萌發生長，長出新的菌絲繼續繁殖。水黴病的發生過程可以是孢子侵染傷口或菌絲粘附傷口，導緻水黴菌大量繁殖引起發病。水黴病的防控一定要注意的是，用能殺滅遊動孢子的産品提前殺滅孢子，避免魚體表面的菌絲末端孢子囊釋放更多遊動孢子。

水黴菌是水産動物重要緻病菌，感染的水産動物體表覆蓋白色絮狀物菌絲，同時伴随食欲不振，躁動不安和免疫下降。水黴孢子大量繁殖可引起水産動物水黴病爆發。本研究水黴菌落形态結果顯示，水黴在PDA培養基上形成的菌落呈放射狀，菌落為規則的圓形，邊緣整齊，菌絲深入到瓊脂内部，交織成網狀，生長在瓊脂外部份，為灰白色絮狀物；水黴顯微鏡觀察結果顯示，水黴菌絲為透明管狀結構，頂端為遊動孢子囊，孢子囊中有遊動孢子，發育成熟後從孢子囊頂端釋放出來，并迅速遊離，孢子從孢子囊釋放後，孢子囊前端成為空囊，新遊動孢子囊會以内層擴散方式重新形成。

水黴病的發生特點？水黴發生溫度範圍廣，水黴孢子在自然環境大量存在，對環境耐受性極強，對溫度适應範圍很廣；水黴發生主要受溫度影響，當水溫低于20℃時水黴病原菌适宜繁殖,其最适繁殖溫度為10-18℃，水黴菌在15℃左右時生長最活躍，水溫高于28℃才能抑制水黴孢子繁殖。因此，水黴病并不是隻有冬季低溫期發生，水溫低于20℃都要預防該病的發生；水黴發生的後期，水黴菌菌絲着生在水體表傷口後，菌絲會深入肌肉，很難殺滅，因此水黴病主要靠預防。在水黴适宜繁殖的季節（水溫低于20℃）提前使用藥物将水黴孢子殺滅在水體中（如華揚君美淨）；水黴菌感染對象多，水黴病是由水黴菌引起的真菌性疾病，對水生動物種類沒有選擇性，凡受傷的機體和卵均可被感染緻病。

如何有效防控水黴病？（1）選擇有效防治水黴病的藥物很關鍵。防治水黴病的藥物有很多種，如何選擇有效藥物直接決定了防治效果。防治水黴病的藥物可以分為抑菌型的主要用于預防，如硫醚沙星等，主要是抑制水黴菌的生長，一旦觀察到白毛菌絲，如果不能殺菌是沒有治療效果的；有去除菌絲性和恢複傷口型的，如五倍子、水楊酸等，主要用于脫落菌絲和收斂傷口，不能殺滅水黴，也起不到治療效果；一種是治療型的，具有殺菌效果，可以殺滅水黴菌，具有真正的治療效果。華揚君美淨融合了五倍子提取物收斂傷口和抑殺水黴菌的雙重效果具有很好的防治水黴病效果。（2）秋冬捕魚時，避免和減少魚體受傷。（3）及時殺滅水體和魚體體表寄生蟲，減少寄生蟲造成傷口和病菌傳播。（4）越冬前提前内服應激甯等中藥類産品，提升魚體體質，增氧機體免疫力。（5）在水黴适宜繁殖季節（水溫10-18℃）提前使用可抑殺水黴孢子的産品，将水黴孢子抑殺在水體中。

4 參考文獻

[1] Behrens P W, Sicotte V J, Delent s J. Microalgae as asource of stable iso topically labeled compounds.Journal of Applied Phycology, 1994, 6 (2): 113- 121.

[2] Ke X, Wang J, Gu Z, et al. Saprolegnia brachydanis, A New Oomycete Isolated from Zebra Fish[J]. Mycopathologia, 2009, 167(2):107-13.

[3] Khulbe R D, Bisht G S, Chandra J. An ecologicalstudy on watermolds of some rivers of Kumaun H imalaya. Journal of the Indian Bo tanical Society, 1995, 74 (3): 61- 64.

[4] Seymour R L. The genus Saprolegnia. Nova Hedwigia, 1970, 19: 1-124.

[5] 韓靈莉. 七彩神仙魚水黴病的鑒定及其防治方法的研究[D]. 上海海洋大學. 2017.

[6] 梁永增. 魚類水黴病病原生物拮抗菌的篩選及其拮抗機理分析[D]. 新疆大學. 2016.

[7] 劉榮軍. 30種中草藥提取物對多子水黴體外抑制作用研究及厚樸抗水黴活性成分初步分析[D]. 四川農業大學. 2014.

[8] 夏文偉. 鲫卵源緻病性水黴的分離與鑒定及其生物學特性研究[D]. 上海海洋大學. 2011.

[9] 許佳露.魚類水黴病疾病模型的構建及應用[D]. 上海海洋大學. 2012.

[10] 張楠. 中國主要緻病性水黴菌病原及水黴病暴發預警研究[D]. 上海海洋大學. 2014.

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