8月2日，中國科學技術大學生命科學與醫學部教授孫林峰團隊在《自然》（Nature）上，發表了題為Structural insights into auxin recognition and efflux byArabidopsisPIN1的研究論文，報道了植物中生長素極性轉運蛋白PIN1，以及它分别與底物生長素（IAA-bound）、抑制劑NPA（N-1-naphthylphthalamic acid，又名抑草生）結合的（NPA-bound）三個高分辨率結構，并結合功能實驗闡釋了PIN1蛋白的工作機制，為剖析植物生長素運輸調控以及針對PIN蛋白的農業用除草劑和植物生長調節劑的設計開發奠定了重要基礎。

1880年，達爾文父子在《植物的運動力》（The Power of Movements in Plants）中提出了植物莖頂端會産生某種物質導緻“向光性”生長的猜想。1928年，荷蘭科學家F.Went通過“溫特實驗”（燕麥胚芽鞘彎曲實驗）證實了這種物質的存在并首次提出了“生長素”的概念。科學家的進一步研究确定植物中主要的生長素為吲哚-3-乙酸（IAA，Indole-3-acetic acid）。作為第一種被發現的植物激素，生長素幾乎參與了植物生長發育調控的每一個過程，例如胚胎發育、根發育、葉發育、花發育、向光性和向重力性等。區别于其他植物激素，生長素的一個顯著特點是其細胞與細胞間的運輸過程具有方向性，這一過程稱為生長素極性運輸（Polar Auxin Transport，PAT）。生長素極性運輸通過與其合成和代謝途徑共同配合，産生濃度梯度和局部濃度差異，建立調控植物生長發育、“向性生長”的基礎，響應内外界信号刺激。在生長素極性運輸過程中，位于膜上的轉運蛋白發揮了關鍵作用，其中生長素外排蛋白家族PIN（PIN-FORMEDauxin exporter）尤為重要。研究表明，PIN蛋白成員在細胞質膜上具有不對稱分布的特點，其極性定位與生長素運輸方向高度關聯，是生長素在植物體内不對稱分布的重要原因。由于缺乏精細的三維結構，PIN家族蛋白特異性識别、轉運生長素的機制未知，這是生長素研究領域亟待解決的關鍵科學問題。NPA是之前實驗室廣泛應用的一種生長素極性運輸抑制劑，也是農業生産中最早作為除草劑應用的化學小分子。生化證據表明，NPA可以直接靶向PIN蛋白，但如何發揮作用尚不清楚。

在模式植物拟南芥中，PIN家族包括8個蛋白成員，即經典的、主要分布于細胞膜上的、具有較長胞質loop環的PIN成員（PIN1~PIN4和PIN7），非經典的、分布于内質網上的、具有較短胞質loop環的PIN成員（PIN5和PIN8），以及胞質loop環長度介于二者之間的PIN6蛋白。PIN1是最早鑒定的PIN家族成員之一，其基因突變導緻植物産生裸露的針狀（pin-formed）花序，該家族由此得名。本研究中，孫林峰團隊針對PIN1這一經典的PIN家族成員展開研究，搭建了一套全新的基于放射性同位素和哺乳動物HEK293T細胞的檢測PIN1蛋白生長素外排功能的生化體系，驗證了其轉運活性，證實了PIN1受蛋白激酶激活調控、被NPA抑制的過程，并為PIN介導的生長素運輸機制研究提供了可靠的便捷手段。此外，科研團隊利用質譜分析技術，鑒定了多個位于胞質loop環的磷酸化位點，為進一步探究PIN受磷酸化調控的機制提供了線索。

在功能分析的同時，研究團隊利用HEK293F細胞瞬時表達系統表達、純化得到了拟南芥PIN1蛋白。為了解決蛋白構象不穩定及分子量較小的問題，孫林峰團隊與中科院分子細胞科學卓越創新中心李典範團隊合作，利用體外納米抗體合成技術，得到大量靶向PIN1蛋白的納米抗體，進一步通過親和力、熱穩定性分析縮小了抗體篩查範圍。最終，研究利用冷凍電鏡單顆粒重構技術，解析了PIN1與一種納米抗體結合的、分辨率為3.0埃的結構，首次揭示了經典PIN家族蛋白成員的樣貌。PIN1以對稱性的同源二聚體方式組裝。每個PIN1單體具有10次跨膜螺旋，呈現出典型的NhaA蛋白折疊方式，劃分為Scaffold結構域和Transporter結構域。PIN1呈現向細胞質側開放的構象，同時，胞質側有一個由b折疊片組成的結構域，區别于近期報道的同家族成員PIN8蛋白的結構。通過在蛋白中添加底物IAA和抑制劑NPA，研究又分别得到了PIN1蛋白分别與兩種小分子結合的複合物結構。在這些結構中，科研人員清楚地觀察到IAA和NPA結合的結合位點以及相互作用氨基酸殘基，并通過突變、ITC結合常數測定和轉運分析驗證了這些殘基的重要性。雖然IAA和NPA在結合方式上具有一定相似性，但由于NPA分子更大，通過與PIN1産生更多的氫鍵和疏水性相互作用，以一種親和力更高的方式結合，并使蛋白處于朝内側開放的構象，從實驗上驗證了NPA的高效抑制作用。此外，研究探讨了PIN家族蛋白轉運IAA的驅動力和能量來源，轉運實驗分析發現跨膜質子梯度對于IAA運輸影響較小，暗示PIN不依賴質子梯度提供能量。

該研究揭開了植物經典PIN家族蛋白的結構面紗，系統闡釋了PIN1識别底物生長素IAA以及被NPA抑制的分子機制，為科學家闡釋植物生長素極性運輸過程提供了重要幫助，為基于靶向該家族蛋白的小分子抑制劑設計奠定了基礎，并對指導農業應用具有重要意義。

研究工作得到中科院戰略性先導科技專項（B類）、國家自然科學基金、安徽省自然科學基金、中央高校基本科研業務費專項資金、中國科大統籌推進世界一流大學和一流學科建設專項資金等的支持，并獲得教育部無膜細胞器與細胞動力學重點實驗室、合肥微尺度物質科學國家研究中心、生物醫學與健康安徽省實驗室的支持。冷凍電鏡數據收集工作在中國科大冷凍電鏡中心和生物物理所生物成像中心完成。奧地利科技學院科研人員參與研究。

拟南芥PIN1蛋白三種狀态下的結構和轉運機制示意圖

來源：中國科學技術大學

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