SCI 生信人

我們先回顧一下以前的高通量測序類的文章，當某項測序技術剛剛興起的時候，單純的生信分析就可以發比較好的期刊，最大的原因就是技術和創意新穎。但随着技術的發展，價格的下降，這些文章越來越多。于是審稿人就要求測序類文章要加以基礎實驗驗證。尤其是高分測序文章，甚至用體内動物實驗（in vivo）和體外細胞實驗（in vitro）來升華自己的文章。但是對于單細胞測序而言，其技術角度和常規的測序文章明顯不同。我們會感覺單細胞測序類文章會有大量生信分析的部分。但是這類文章還是會穿插一些基礎實驗來提升文章的檔次。在小編看過了許多篇關于單細胞測序的文章後，為大家總結出單細胞測序中的“濕”實驗。下面我就為大家具體介紹下這類實驗~

一、流式技術

同樣，流式細胞儀（flow cytometry，FCM）也是作為一種強大的單細胞分析工具。流式細胞術是利用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀态中的細胞或生物顆粒同時進行多參數、快速定量分析和分選的高新技術。

其主要的流程如下：

• 制備單細胞懸液并熒光染料标記抗體進行染色。
• 收集單細胞上的熒光信号。
• 利用熒光信号的強度統計細胞膜表面抗原強度或細胞内物質的濃度。
• 根據所測定的參數做細胞分選。

舉個栗子：

在下面的這篇文章中[1]，作者建立了非肥胖糖尿病(NOD)自身免疫小鼠模型，并在4、8、15周取小鼠胰島組織做了單細胞測序。在這3個時間點，作者發現胰島内浸潤的細胞主要是T細胞、B細胞和cDCs。流式細胞術證實了胰島内主要細胞群的存在，并且sc-RNA seq鑒定的浸潤模式涵蓋了了流式細胞術的數據。

二、免疫熒光技術

免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理，先将已知的抗原或抗體标記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞内的相應抗原（或抗體）。這使得組織或細胞内形成的抗原抗體複合物上含有标記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察标本，熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光，可以看見熒光所在的組織細胞，從而确定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

一般的流程如下：

舉個栗子：

在下面的這篇文章[2]中，作者發現胃粘液分泌細胞主要主要由表達MUC5AC的PMCs（pit mucous cell）和表達MUC6的GMCs（gland mucous cell）組成。利用PCA（主成分分析）發現這些表達MUC6的腺細胞明顯分為兩個亞群。簇1的表達特征符合正常胃窦腺細胞的分子特征，但是簇2的表達特征主要由腸幹細胞或發育相關基因組成，包括OLFM4、PHLDA1和LEFTY1。所以作者用免疫熒光(IF)染色證實了MUC6和OLFM4以及LEFTY1是共同表達的（獲得腸幹細胞表型）。

三、免疫組化

免疫組化，免疫組織化學技術(immunohistochemistry，IHC)，也是是一項利用抗原抗體反應，通過使标記抗體的顯色劑顯色來确定組織細胞内抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術。免疫組化主要用的是組織标本和細胞标本兩大類，組織标本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片，對組織形态保存好，保存時間也長，雖然對組織抗原暴露有影響，但可以抗原修複，所以石蠟切片仍然是首選的标本制作方法。

免疫組化流程如下：

舉個栗子：

在下面的這篇文章[3]中，作者通過對EOC（上皮卵巢癌）患者卵巢組織單細胞測序内容的分析确定了腫瘤細胞内兩個亞群的生物标志物後（CYR61/RGS5），作者在8個卵巢癌樣本中應用了CYR61和RGS5的IHC共染色，以驗證樣品制備和scRNA-seq的生信分析的可靠性。IHC結果證明，CYR61 腫瘤細胞和RGS5 CAFs的比例與scRNA-seq結果是一緻的。

大家有沒有覺得很熟悉？免疫組化和免疫熒光有點相似。下面我為大家總結一下兩者的異同點。方便大家選擇 。

相同點：

兩者都是利用抗原抗體結合原理在蛋白層面進行研究。

不同點：

1、标本制作：免疫熒光一般用冰凍切片，減少雜質幹擾；而酶免疫組化一般用石蠟切片或冰凍切片均可以。石蠟切片，對組織形态保存好，保存時間也長，所以石蠟切片仍然是免疫組化首選的标本制作方法。

2、實驗步驟：免疫熒光染色步驟簡單，而酶免疫組化方法較為複雜，多了DAB顯色過程。3、标本保存：免疫熒光染色後的标本一般短時間拍照，時間長了熒光衰退；而酶免疫組化染色标本可以長期保存。

4、結果展示：免疫熒光得到的圖片是彩色的，上檔次。免疫組化結果除了知道蛋白是在細胞漿還是細胞膜表達高些，還可以用軟件做相對定量分析。

四、免疫印迹

Western Blot蛋白免疫印迹是對目的蛋白進行檢測、分析以及定量的一種技術。蛋白質樣品經SDS-PAGE 分離後從凝膠轉移到固相支持物（如PVDF膜）上，後用特異性抗體對某一特定的抗原進行着色，分析着色的位置或深度獲得該蛋白質在所分析的細胞或組織中的表達情況。其可以說是檢測蛋白質的金标準（受到審稿人青睐）。下面是WB的一般流程:

舉個栗子：

在下面這篇文章[4]，作者對從健康和NASH（非酒精性脂肪肝）小鼠肝髒分離的非實質細胞進行單細胞RNA測序。通過一系列分析工作，作者為代謝組織中的非實質細胞類型在代謝控制和疾病進展中發揮更普遍的作用。其中如下圖所示，作者就利用WB技術證明了在喂食CDAHFD（高脂飲食）的小鼠中，服用Elafibror後，肝髒GPNMB蛋白表達和血漿GPNMB水平也一直降低。

五、RNA-FISH

FISH當然不的魚的意思，FISH是指熒光原位雜交技術(Fluorescene in situ hybridization, FISH)的縮寫。FISH是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術。是利用DNA堿基互補配對的特點，在體外一定的條件下，使同源的DNA鍊或DNA-RNA單鍊結合成雙鍊，以熒光标記取代同位素标記而形成的一種新的原位雜交方法。

下面分享下RNA-FISH心得體會

• 前期标本制備和蛋白酶K的作用濃度：蛋白酶K濃度影響細胞核形态，造成模糊不清，濃度低了則探針不易進入細胞核，雜交率大大降低。
• 探針标記：就是一句話--買好點的。
• 雜交：這步的動作要領是輕柔地按一點。另外我師兄告誡我：在封片時，一定要密封好玻片，可以采用凝膠類的物質封住四 周。雜交條件：孵育時間一般20h左右。溫度要嚴格控制在36-40℃之間，過高或者過低都是不适合的。
• 顯帶：感覺沒啥要注意的細節~
• 顯微鏡觀察：封片後标本要盡快檢測和觀察。每一次熒光顯微鏡的觀察都會淬滅一部分信号，因此一定要快速觀察和采集圖像。

舉個栗子：

在下面這篇文章[5]中，作者分析了兩個果蠅的睾丸單細胞RNA序列(scRNA-seq)數據。作者發現有證據表明，X染色體在體細胞和減數分裂前細胞中的轉錄活性與常染色體相同，而在減數分裂和減數分裂後細胞中的轉錄活性低于常染色體。通過scRNAseq和RNA-FISH，作者發現大多數msl（male-specific lethal）基因MLE、roX1和roX2的胚系表達水平很低或檢測不到，沒有胚系核roX1/2定位的證據。scRNAseq和RNA-FISH的結果相似互相印證。

六、譜系示蹤技術

這個技術相對來講就複雜了點。首先多細胞生物的生長發育基于細胞分裂和分化。在哺乳動物的胚胎發育早期階段，每個細胞就已經被賦予了特定的分化潛能( cell totipotency)，這種特性在後期發育過程中才逐漸表現出來，最終分成為不同的組織、器官類型。另外一方面，某些終末分化的成體細胞在一定的生理或者病理條件下會發生去分化( dedifferentiation)或者轉分化 ( transdifferentiation)，變為另外一種細胞或組織類型，例如腫瘤的發生、心髒成纖維細胞再編程轉分化為心肌細胞等現象。細胞的命運決定是指單個細胞及其所有後代細胞的分化和發育活動，對細胞的命運決定進行追蹤和觀察稱為細胞譜系示蹤。

以Cre-loxP 同源重組系統為例介紹一下大概流程：

在含有 Cre 的轉基因小鼠中，Cre 在特性基因的啟動子驅動下，在特定的細胞類群中表達，當 Cre 小鼠與含有 loxP 位點的報告基因小鼠交配後，Cre 通過識别 loxP位點，将兩個 loxP 位點之間的終止序列切除，從而使含有 Cre 的細胞類群表達出報告基因，由于這種切除是位于基因上的，從而是永久性的和不可逆的，因此，所有表達 Cre 的細胞類群及其後代都将永久的被報告基因蛋白标記上，因此，利用該細胞追蹤技術可以解析特定細胞的起源和命運。

舉個栗子：

在下面這篇文章[6]中，作者通過遺傳譜系追蹤和單細胞RNA測序，發現Lepr-Cre标記了成年鼠長骨中大部分的骨髓基質細胞和成骨細胞。瘦素受體(Lepr)陽性細胞是骨髓造血微環境的重要組成部分，高度富集在骨骼幹/祖細胞，可以維持成人骨骼内環境的穩定。然而，這個群體中的異質性一直難以捉摸。Lepr-Cre示蹤細胞在穩态和應激條件下的綜合分析揭示了成脂、成骨和骨膜譜系的動态變化。通過對8周齡Lepr-Cre小鼠股骨遠端的免疫熒光顯像（骨折前後）。作者發現雖然在骨折前僅能檢測到少量Lepr-Cre 骨膜細胞，但骨折和照射後骨膜細胞明顯擴張。

小編總結：

介紹了那麼多實驗，但是具體該選擇哪一種實驗還要結合實驗内容，實驗周期，實驗費用來确定。但是有驗證實驗的話絕對可以提升文章的檔次！好了，今天關于單細胞測序中的“濕”實驗方法就列舉到這裡，如果你在單細胞測序文章中還發現其他的“濕”實驗，可以留言供大家一起學習~~

更多精彩资讯请关注tft每日頭條，我们将持续为您更新最新资讯!