不同方向的文章包含不同的實驗技術，但是核心思路都是相似的。大多數科研工作者是通過閱讀文獻獲得思路，但是如果沒有自己的研究基礎或者研究積累，也不了解每個實驗的具體原理也沒有豐富的實驗經曆，可能花費大量時間精力還吃虧不讨好。那麼，如何開展一個課題呢？下面小編就以一篇文獻為例，講述一下這篇文獻中的思路和部分實驗技能，希望大家能舉一反三，從中學得一些“套路”。

以2015年的一篇發表在Plant Cell 題目為Systemic Immunity Requires SnRK2.8-Mediated Nuclear Import of NPR1 in Arabidopsis 的文獻為例，首先小編讓大家快速了解一下課題設計和主線：

圖1：課題主線

不論研究對象是植物還是動物，核心思路都是這樣的。查閱文獻尋找背景和線索-發現表型-機制解析，基于這三點我們再根據具體課題設計各種驗證實驗，下面就這篇文獻進行分析。

一 背景和線索

圖2 ：文獻背景

已有研究表明植物體被外界病原菌入侵時，入侵部位發生快速而劇烈的細胞死亡的同時會殺死病原菌,遠離被病原菌感染部位的部分會通過SA激活NPR1從而誘導SAR（系統獲得性抗性）。但作者發現在感染病原菌時遠端的SA含量隻有少量增加，說明SA調節的SAR還需要額外的因子。此外，有文獻報道SnRK2.8可以磷酸化NLT6等轉錄因子，而NLT6參與冷誘導的抗病過程，因此推測SnRK2家族成員可能參與SAR。

二 表型發現

SnRK2家族成員是否參與SAR呢？首先作者通過體外實驗發現SnRK2.8的表達量确實受外來病原菌調控；其次SnRK2.8基因超量植株相比野生型更耐細菌侵染，且對snrk2.8突變體和野生型注射病原菌，野生型中快速有效地産生SAR而突變體中不能引起SAR，說明SnRK2.8确實參與SAR過程。

圖3：體外體内實驗探索SnRK2.8和SAR的關系

三 機制探究

SnRK2.8蛋白在SAR中發揮什麼功能呢？查閱大量文獻發現SA對SAR的誘導是必須的，因此需要首先判斷SnRK2.8在SAR中發揮功能是否和SA有關。到底是SnRK2.8影響SA的含量還是SA能誘導SnRK2.8的表達，或者是SnRK2.8參與SAR依賴于SA。作者利用一系列實驗發現SnRK2.8不影響SA的積累并且SA不能誘導SnRK2.8的表達但是SnRK2.8調控SAR是依賴于SA的。其次，SnRK2.8作為蛋白激酶如何調控SAR？SnRK2.8是否參與已報道的調控SAR的信号網絡呢？SnRK2.8蛋白調控的上下遊是什麼呢？作者通過酵母雙雜、BIFC及CO-IP等發現SnRK2.8确實和已報道參與SAR過程的NPR1蛋白互作。由于SnRK2.8蛋白是激酶并且有文章報道NPR1參與SAR必須以二聚體形式進入核中才能發揮共能，最後作者确定SnRK2.8能磷酸化NPR1從而促進NPR1的入核。

圖4：SnRK2.8和SA的關系分析

圖5：各種體内實驗驗證SnRK2.8和NPR1互作

圖6：體外體内實驗證明SnRK2.8在SAR中調控NPR1入核過程

上述基本就是這個課題的全過程，但是文章的完成不能隻有思路，還需要紮實的實驗技能，思路和實驗技能是相輔相成的，缺一不可。下面給大家簡單介紹一下這篇文獻中涉及到的部分實驗技能，希望對大家有所幫助。

四 實驗要點

1. 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

通過熒光染料或熒光标記的特異性的探針，對PCR産物進行标記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對産物進行分析，計算待測樣品模闆的初始濃度。一般我們可以通過qRT-PCR比較不同樣品之間特定基因的表達量變化，此實驗在這篇文獻中用得相當多，算是基本操作，其中有很多需要注意的地方，下面我為大家介紹一下。

（1）RNA是否降解

Nanodrop 2000 隻能檢測RNA的濃度及純度，對于RNA的完整性是沒法檢測的，一般實驗室可以通過凝膠電泳檢測，所有試劑和接觸到RNA的儀器用DEPC沖洗，盡量保證膠的一緻性，在nuclease-free情況下進行電泳，電壓不要太高，否則因為溫度高RNA會降解。

（2）cDNA 濃度是否一緻

按道理說每個樣品用相同含量的RNA進行反轉錄得到的cDNA應該一緻，但是我們檢測的RNA每個樣品可能含有蛋白雜質，所以取的RNA模闆可能不一緻，先用看家基因檢測一下稀釋到80ng/ul左右的樣品再來判斷cDNA濃度是否一緻。

（3）引物是否合适

做半定量PCR引物很重要，曾經看過一篇文章，作者對3kb的片段共設計了8對不同位置同樣長度的引物，PCR檢測表達量發現絕對量都不一樣，并且引物的Tm值以及長度都影響着擴增效果。因此引物是否合适很重要，并且擴增片段長度不能太長，一般70bp到300bp都是可以的。

（4）加樣一緻性

做q-PCR很重要一點就是加樣一緻，因此我們均是配置MIX後再來分裝，分裝時用分裝槍，因為手動加樣可能會不均勻。一般使用RNA的EP管和槍頭，因為RNA的槍頭對于液體的粘着性比較低，可以盡量減少樣品滞留在槍頭上。一般每個樣至少保證3個重複。

（5）PCR闆保證幹淨

不要徒手撫摸PCR闆的上方和下方，因此也不要在PCR上畫标記，會影響熒光信号的采集。貼膜時一定要貼牢固了，不然可能做完RCR你的樣品也蒸幹了，我們實驗室的新手經常犯這樣的錯誤。

（6）冰上操作

一般做一整闆PCR可能耗時太長，有的人甚至能用一兩個小時，但是SYBR mix中有酶因此需要冰上操作。

2.酵母雙雜交

酵母雙雜交系統是在酵母體内通過重建有活性轉錄因子的結構來鑒定蛋白質之間的相互作用。轉錄因子可以和DNA上特異的序列結合而啟動相應基因的轉錄。這種DNA結合與轉錄激活的功能是由轉錄因子上兩個相互獨立的結構域即DNA結合結構域(Binding Domain, BD)和轉錄激活結構域(Activation Domain, AD)分别來完成的，并且這兩個結構域對于基因的轉錄激活都是必須的。在GAL4系統中利用轉錄因子GAL4的DNA結合結構域GAL4-BD與激活結構域GAL4-AD的特異載體，分别與基因的ORFs融合，轉化酵母細胞。在酵母内表達的蛋白若發生相互作用時，就會将GAL4-BD和GAL4-AD結合在一起，從而與上遊激活序列(upstream activating sequence, UAS)結合，激活相應報告基因的表達，在相應的營養缺陷型培養基上篩選陽性。

在本文獻中作者通過此方法證明SnRK2.8和NPR1、TGA3互作，此實驗中有以下幾點需要注意：

（1）驗證目的蛋白自激活活性

進行篩選之前必須驗證目的蛋白是否有自激活，如無自激活活性可用于酵母雙雜交篩庫，如有自激活必須把自激活區域去掉才能用于酵母雙雜交文庫篩選。有些蛋白自激活特别強，可能需要截成特别短的片段才能進行篩選，這些都需要驗證。

（2）确定3-AT濃度

跟其他驗證蛋白互作實驗一樣，酵母雙雜也需要陰性對照，必須驗證目的基因連接BD的菌株和包含AD空載的菌株之間不會有互作，但是一般在沒有抑制劑存在時上述情況是能發生的，那麼在三缺培養基上仍然能長，因此出現假陽性。所以一般用含梯度的3-AT平闆先做預試驗，确定在什麼濃度下的3-AT能抑制目的基因和含AD的空載的互作。

（3）x-gal顯色時陽性對照很重要

在酵母雙雜最後，能在三缺上長出來的酵母需要進行進一步驗證，就是x-gal顯色。顯色時必須添加陽性對照，證明顯色實驗沒有問題，否則本來是陽性菌卻被認為是假的。

（4）實驗操作中的小細節

a 轉化酵母時，鲑精DNA變性很重要，這是介導質粒進入酵母的輔助物；

b 在熱激酵母之前，轉化Mixture中每加一種組份都要吸打均勻，以免出現沉澱；在轉化效率不能滿足實驗需要時，可增加體系中Salmon Sperm DNA的濃度。

c 确定3-AT濃度時，最好确定兩次以上，因為3-AT濃度決定着你的結果是否正确。

d mating時，不要用過小的三角瓶，以免降低轉化效率；搖動速度不可過高以免降低 mating 效率，也不可過低防止酵母細胞沉澱。

e 檢測菌液OD600時，應稀釋2倍及5倍後測定，再計算原液的濃度。

3 Pull Down 和CO-IP

簡單講Pull Down 和CO-IP都是為了驗證兩個蛋白是否互作的方法，隻是一個是驗證體外蛋白互作，一個是驗證體内的。但是原理都是一樣，都是通過标記的标簽蛋白（體外一般是GST,HIS,MYB等，體内一般有HA,GFP,FLAG,Strep等标簽）從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白，确認兩個蛋白之間是否互作。一般是用Western blot檢測。在整個過程中有哪些需要注意的呢，小編也為大家整理了一些。

（1）濃度低和純度低的蛋白也能上樣

很多人可能認為做Pull Down 和CO-IP實驗的蛋白樣必須高濃度和高純度，其實不然，對于此實驗我們最終是利用用Western blot來檢測靈敏度相當高，此外當蛋白濃度不夠時我們隻需要加大蛋白量就可完成此實驗；至于有雜帶也沒有什麼影響，隻要用Western blot檢測時能檢測到真正的目的帶即可。

（2） 陰性對照很重要

很多人做Pull Down 和CO-IP會将實驗組和對照組分開做，這樣其實是不嚴謹的。我們必須保證整個實驗流程一緻才能證明目的蛋白之間存在互作，因為這個實驗彈性很大，如果孵育時間太長，而wash時間又太短，空GST也能和目的蛋白互作，這種情況我們實驗室有很多，所有不能先做實驗組證明有互作了，就随便加一組對照。

（3） 孵育時間看自己

這個意思就是做Pull Down 和CO-IP的時間可以自己定，這個過程不同蛋白之間是不一樣的，有的蛋白互作可能特别強，因此可以直接孵育1h就可以，有的蛋白可能互作比較弱，可能需要孵育4h或者過夜。因此這些都取決于你的蛋白之間的結合力。

（4） 預試驗不可缺

什麼叫預試驗呢，就是對于新手來說你在做Pull Down 和CO-IP時每一步的流出液或者洗脫液都應該收集起來進行檢測，這樣是為了更好分析你的實驗是在哪一步出錯，否則實驗失敗以後也不明白為什麼，隻能無意義的重複，浪費時間和精力。例如我見過我們實驗室一員她在input中檢測到蛋白，在wash buffer和流出液中及elution中都沒有檢測到蛋白，因此她認為沒有互作，其實我們應該分析蛋白去哪了，既然input有，但是哪裡都沒有蛋白說明目的蛋白在beads沒有被elution下來，有可能互作蛋白都在beads上而你沒有檢測到。

（5） 蛋白提取液非常重要

不用類型的蛋白提取液不同，對于一般核或者質蛋白可能SDS溶液即可，但是對于一些膜蛋白就有特殊的提取方法。如果這一步不區分開可能完全沒有辦法進行後續實驗。

4 煙草體系BIFC

在熒光蛋白（YFP、GFP、Luciferase 等）的兩個β片層之間的環結構上有許多特異性位點可以插入外源蛋白而不影響熒光蛋白的熒光活性。BiFC 技術正是利用熒光蛋白家族的這一特性，将熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分别與目标蛋白融合表達。如果兩個目标蛋白因物理相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成有活性的熒光基團而發出熒光，此實驗都用于在煙草植株活體細胞中檢測蛋白質-蛋白質相互作用。此實驗有這幾點需要注意：

（1） 農杆菌的選擇

GV3101、EHA105、LBA4404 這三種農杆菌均有報道可以用于煙草瞬時轉化。在培養農杆菌時候除了添加載體所含有的抗生素外，不同農杆菌還需要添加其它種類抗生素，比如 GV3101 還需要添加 50μg/ml 的利福平。

（2） 煙草狀态很重要

選擇健康、處于壯年的煙草葉片進行注射，太小的可能注射不進去，太老的表達效率較低。葉片氣孔打開的時候比較容易注射，因此最好在白天注射。

（3） 适當的農杆菌菌液濃度

農杆菌菌液濃度是需要自己摸索的一個參數，OD600 = 0.6并不一定适用于所有的基因，高濃度可能導緻葉片死亡，或者影響定位結果，建議設置不同濃度梯度進行比較，在可以獲得熒光信号的前提下盡量采用低濃度的菌液。

（4） 農杆菌活性相當重要

在YEB中培養農杆菌時，OD一般達到0.8-1時菌的活性最佳，在0D超過1後甚至1.5後，可能因為活性不夠而導緻熒光很弱，最終判斷錯誤。因此，盡量保證農杆菌活性。

（5）預試驗判斷轉化效率

不同外源基因的瞬時表達效率大不相同——這一點在單轉做亞細胞定位的時候表現得特别明顯，效率高者基本每次都能達到100%發光，低者可能轉10次隻能表達出一兩次，建議在BIFC之前先做個亞細胞定位評價一下兩個基因的表達效率，以便調整兩個質粒的轉化條件。

（6） 觀察時間

注射後的植株通常在2d之後觀察，但不同基因表達的時間可能在1-7天不等，需要第一次實驗時每天都觀察一下，判斷什麼時候表達量最強。

5 蛋白質磷酸化活性分析

蛋白質磷酸化指的是由蛋白質激酶催化的把三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）或三磷酸鳥苷（Guanosine triphosphate, GTP）γ位的磷酸基團轉移到底物蛋白質氨基酸殘基（如絲氨酸、蘇氨酸等）上的過程。本文獻中以放射性同位素标記的[γ-32P]ATP作為磷酸基團的供體，SnRK2.8與待NPR1共同反應30min，之後通過 SDS-PAGE 凝膠電泳分離，用放射自顯影或磷儲屏檢測磷酸化蛋白質，從而判斷待測蛋白質是否具有磷酸化活性或自磷酸化活性。這裡小編也總結了幾點注意要點，提供大家參考。

（1）磷酸化反應過程

對于某些對特殊離子具有依賴性的蛋白激酶（如鈣離子依賴性蛋白激酶），應對 kinase buffer 中的成分進行調整；此外不同類型的蛋白激酶buffer也有所不同，若是從未做過磷酸化的蛋白，需要自己嘗試不同的反應體系；至于反應溫度和反應時間，一般是室溫反應30min，但是對于某些對溫度敏感的蛋白激酶，應調整反應溫度，時間也可以自己延長到6h。

（2）操作謹慎

放射性同位素操作應在規範的專用操作室内進行；含放射性同位素的廢棄物（廢紙、廢液等）應按規定進行規範處理。

（3）蛋白活性

盡量避免待測蛋白在制備過程中活性受到損害，如果蛋白質活性不夠，實驗結果将完全不可信。

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