作者：林麗開

單位：武漢大學醫院管理研究所，武漢大學中南醫院

2019年末，新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情暴發并随之席卷全球，嚴重威脅着人類的健康。作為一種新發傳染性疾病，對引發疫情的病毒的及時分離、鑒定成為全球科學抗擊COVID-19疫情的先導條件，凸顯出臨床微生物檢測技術作為精準識别傳染性疾病的重要性。在此基礎上，通過新冠病毒核酸檢測技術在全國範圍内廣泛實施“應檢盡檢”和“願檢盡檢”的防控策略，是中國及時有效控制COVID-19疫情的“精準利器”。由此可見，臨床微生物檢測技術在應對重大公共衛生事件中發揮着重要作用——預警監測是應對重大公共衛生事件的第一道防線，而完善的臨床微生物檢測技術體系是實現準确“預警監測”的基礎保障。

同時，感染性疾病也是一種常見的影響人類健康的疾病，各種社區/醫院獲得性感染廣泛存在于臨床各科患者之中，抗感染藥物成為臨床應用最廣泛的藥物之一。然而，由于抗感染藥物的不合理使用，對抗感染藥物的多重耐藥與泛耐藥等問題日益加重，成為全球性公共衛生問題。對引發感染的病原體的早期識别，是減少盲目經驗性用藥、降低廣譜抗感染藥物使用比例、實現通過精确合理化用藥，減緩、遏制耐藥性發展的前提——而對病原體的早期識别，也有賴于完善的臨床微生物檢測技術體系建設。準确、快速是臨床實踐對于病原體檢測的要求。随着檢測技術的快速發展，除了塗片、染色、分離、培養、藥敏等傳統方法以外，基于PCR原理進行延伸的第二代測序（Next generation sequencing, NGS）技術、将實驗平台縮小至芯片的微流控技術等新的檢測手段不斷湧現——新技術的發展在保證檢測的敏感性的同時，能夠降低假陽性，而且大幅度提升檢測速度，得到臨床醫務工作者的“青睐”。值得注意的是，傳統的形态學檢驗、培養仍然是臨床微生物檢測技術的基本功，是病原體識别和鑒定的金标準，不應該因新技術的發展而被輕視或遺忘。本文将對現今臨床微生物檢測的新技術進行述評，明确前沿方向，以期不斷改進、優化、完善臨床微生物檢測技術體系，更好地契合臨床實際需要。

一

高通量測序技術

高通量測序技術，即第二代、第三代測序技術，區别于傳統的Sanger末端終止法測序[1]，可實現一次并行幾十甚至上百萬個DNA分子克隆進行測序，是研究遺傳組學的基石手段。第三代測序技術正處于不同的研發和應用階段，并呈現出各自的優點與缺點。目前臨床實際應用的以NGS為主，比較成熟的NGS平台有454焦磷酸測序、Illumina/Solexa、SOLiD等，均包括模闆預備、測序、成像和數據分析四個環節。其中，獨特的模闆預備是NGS實現高通量的關鍵所在：在該過程中，待測序的不同模闆附着或固定于固體支持物表面，各自獨立被測序而互不幹擾，即使是極大通量模闆也可同時進行測序，從而達到提高效率、縮短時間的目的[2]。

既往對于病原微生物分子層面的分析多集中在少數靶點，而借助NGS的高通量技術，可直接針對樣本中所有核酸進行無偏性測序；在此基礎上，結合病原微生物數據庫及生物信息學工具，分析樣本中含有的可能病原微生物序列，大幅度縮短檢測周期[3, 4]。

由于檢測過程中使用了PCR技術，NGS具有傳統核酸檢測的優點，其應用補充了傳統的Koch法則，可檢測難培養、罕見或新發病原微生物，并可同時檢出多種病原微生物信息。基于此，對檢出的非預期病原體不應輕易視為污染，若這些非預期病原體的存在符合臨床診斷，則可考慮基于該病原體的藥物全覆蓋治療——不僅避免漏診，也可成為預防院感暴發的一道重要防線[3, 5]。同時，NGS不僅可确定病原微生物的種類，還有可能對耐藥基因進行快速檢測，例如Zankari等利用Illumina平台對含4個菌種的200分離株進行全基因組測序，并對耐藥性進行預測，發現預測結果與臨床表型的符合率高達99.74%[6]。

遺憾的是，進行全基因組測序時，對樣本的處理過程繁瑣，成本較高，尤其是在檢測耐藥基因時，需要已知的耐藥性基因決定子，因此無法檢測新的或非特異的耐藥性，而且也無法提供MIC值[7]，此外，NGS需要超過常規的數據量來檢測病原體的毒力與耐藥性，因此在臨床實踐推廣中仍存在一定的問題[4]。

二

微流控技術

微流控技術并非特異性應用于臨床微生物檢驗，它是一種交叉學科技術所形成的新興分析化學研究平台，可實現對于納克甚至皮克級的微量液體進行化學反應的操控，從而極大提升反應效率，且降低耗材成本。而基于微流控技術形成的微流控芯片又被稱為“芯片上的實驗室”，即将生化反應所需的基本操作單位結合于小芯片上，讓反應依照預先設計的程序逐步進行，例如連續進行核酸提取、純化、PCR、跑膠等操作[8-10]。以真菌的鑒定為例，既往傳統的對于臨床微生物檢驗需要經過培養、PCR、酶聯免疫分析等多個步驟，根據菌種不同可能需要花費2-10天不等的時間，而應用微流控芯片則可将時間縮短至1-2小時之内[11]，可見其效率之高，已經成為“即時檢驗”的首選。

微流控技術在微生物檢驗方面主要應用于對核酸和蛋白質的檢測，覆蓋非常廣泛，現有報道的相關病原體探索包括：（1）細菌：如大腸杆菌、沙門氏菌、金葡菌等；（2）真菌：白色假絲酵母菌等；（3）病毒：H1N1、HIV-1、寨卡病毒、諾如病毒等[9, 11, 12]。2019年暴發的SARS-CoV-2也有應用的報道[13]。微流控技術在自動化、高效率、污染小、高通量、低檢測成本等方面優勢極為明顯；但同時，微流控芯片設計與制作工藝非常複雜，成本昂貴，現階段還不能廣泛地服務于臨床實際，相信随着各項研究的深入，該技術可得到進一步改進、優化、完善，從而在臨床實踐中普及應用。

三

形态學檢驗技術

長期以來，微生物形态學觀察是對于可能感染病原體早期診斷的基礎手段，也是檢驗技術人員的基本功。目前形态學檢驗的臨床實踐主要是在光學顯微鏡或電子顯微鏡下對病原體結構進行觀察描述，發現特征性結構，從而作出實驗室判斷。對于有細胞形态的病原體，通常是使用光學顯微鏡，而針對病毒的形态學觀察則需要高分辨率的電子顯微鏡。不少病毒如新疆出血熱病毒、冠狀病毒、呼腸孤病毒、諾如病毒等均在電鏡下最先發現，因此，電鏡也成為臨床檢測病毒的手段之一[14, 15]。除此之外，電鏡還能夠發現如附紅體、細菌等微生物結構上的特征性表現[16, 17]。但是電鏡觀察對于操作人員技術要求高，而且設備昂貴，靈敏度低，檢測病毒時對于病毒顆粒滴度要求高，難以在臨床普及，臨床更傾向于選擇抗原抗體檢測、核酸檢測等相對便捷、特異的手段。

盡管如此，形态學檢驗因其直觀、快捷等特點，仍然是臨床對多種細菌、真菌、寄生蟲、朊病毒等病原體的診斷手段之一[18]。未來有可能通過優化高精度觀察儀器，簡化繁瑣的檢驗流程，提高觀察靈敏度，從而擴大形态學觀察的應用覆蓋範圍，推動臨床微生物早期診斷的發展。

四

展 望

21世紀，臨床微生物檢測體系機遇與挑戰并存。一方面，全球面臨着細菌真菌耐藥的重大公共衛生威脅，而臨床微生物檢測是抗微生物藥物合理使用的前提條件；另一方面，COVID-19的全球大流行迫使臨床微生物檢測體系對大型新發突發不明原因傳染病的緻病微生物精準識别作出能力提升。從某種意義上說，臨床微生物檢測體系既面臨細菌真菌耐藥的“常态化”威脅，又應具備以COVID-19疫情為代表的“戰時”重大公共衛生事件的應對能力，不斷健全與完善臨床微生物檢測體系是未來應對“平戰結合”的必經路徑。

作為病原體識别和鑒定的關鍵手段，臨床微生物檢測是抗感染藥物合理使用的前提，也是應對重大公共衛生事件的“利器”，具有非常重要的作用。随着科學技術的發展，臨床微生物檢測實踐也在逐漸發生改變。一方面，盡管目前受制于技術發展階段而呈現出硬件或軟件成本過高，第二代或第三代測序、微流控等前沿技術尚不足以服務臨床實踐，但随着技術進步與可及性、可負擔性提高，這些技術勢必會逐漸平面化、普及化，擁有極為廣泛和令人期待的應用前景。另一方面，傳統的微生物檢驗手段，尤其以形态學觀察為代表的“基本功”，也不應被輕視和遺忘；雖然電鏡對于病毒診斷的作用被部分取代，但通過對細胞學特點、微生物形态特征的直觀觀察，有助于臨床對病原體進行早期診斷。故應強化檢驗技術人員對常見病原體形态學掌握的熟練程度，優化形态學檢驗的報告模式[19]，同時還需積極開發新技術，應用到形态學檢驗中，提高其早期診斷的敏感性，擴大其适應面。

參考文獻略

注：本文來源于《臨床實驗室》雜志2021年第3期“微生物與感染”專題

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