糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常見的微血管并發症，也是導緻慢性腎病及終末期腎髒病（end stage renal disease，ESRD）的主要病因，30%~40%的糖尿病患者會發展為DKD[1,2]。研究表明，細胞衰老和凋亡是DKD發病和進展的重要機制[3,4]。研究發現DKD患者腎小管上皮細胞衰老相關蛋白p16的表達變化與其腎組織損傷程度及腎功能均存在顯著關系[5]。動物實驗發現，DKD大鼠腎組織中凋亡相關蛋白Caspase-3 mRNA水平顯著增加[6]。多項研究證實，中醫藥可以通過抑制腎髒細胞衰老和凋亡，改善DKD腎損傷[7,8,9,10,11,12,13]。因此，運用中醫藥抑制腎髒細胞衰老和凋亡，可能成為延緩DKD進展的新策略。

清熱消癥方是北京中醫藥大學東直門醫院腎病專家王耀獻教授多年來治療DKD的經驗方，他認為"熱邪"是DKD發病的主要病因，"伏熱緻癥"是DKD的核心病機，尤其在DKD中期，熱伏腎絡，結為癥瘕，故立清熱消癥法[14]，以清解内積熱邪，消散腎絡癥瘕。前期臨床研究發現清熱消癥法在降低DKD中期患者的中醫證候評分和尿蛋白排洩量方面具有較好的臨床效果[15]。課題組體内實驗表明清熱消癥方可以調控腸源性脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導的下遊炎症通路，降低炎性因子toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表達以及腸源性LPS水平，調節DKD小鼠的腸道菌群，降低DKD小鼠蛋白尿，抑制DKD腎損傷，發揮腎保護作用[16]。中藥的化學成分多樣，靶點繁多，因此本研究旨在通過動物體内實驗進一步明确清熱消癥法是否可以通過抑制腎髒細胞衰老和凋亡，改善DKD腎損傷，延緩DKD進展。

2019年7—11月選用SPF級健康雄性SD大鼠30隻，8周齡，體質量（180±20）g，購自維通利華（北京）實驗動物技術有限公司〔SCXK（京）2012-0001〕。将大鼠飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障環境動物實驗室〔SCXK（京）2015-0001〕，室溫22~25 ℃，濕度45%~60%，光照條件為明/暗交替循環12 h，大鼠自由飲水和飲食，适應性喂養3 d。本實驗由北京中醫藥大學東直門醫院動物實驗倫理委員會批準（編号：19-41）。

鍊脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨号：s0130），購自美國Sigma公司；檸檬酸緩沖液（貨号：C1013）、Masson染液（貨号：G1346）和糖原（PAS）染色液試劑盒（貨号：G1281）購自索萊寶公司；蘇木素-伊紅（H-E）染液（貨号：D006-1-2）購自南京建成生物工程研究所；尿微量白蛋白試劑盒（貨号：ab235642）、p16抗體（貨号：ab51243）購自美國Abcam公司；Caspase-3抗體（貨号：19677-1-AP）購自Proteintech公司；一步法原位末端脫氧核苷酸轉移酶标記技術（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（貨号：C1088）、蛋白酶K（貨号：ST532）購自上海碧雲天生物科技有限公司；山羊血清（ZLI-9056）、内源性過氧化物酶阻斷劑、反應增強液、增強酶标山羊抗兔/鼠IgG聚合物（PV-9001/PV-9002）、熒光封片劑（含DAPI）（ZLI-9557）、中性快幹膠封片劑（ZLI-9516）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。AU480全自動生化儀（日本奧林巴斯）全自動組織處理系統（美國美天旎公司），RM2135病理切片機，烤片機（德國Leica公司），BX60型顯微鏡（日本Olympus公司）。

清熱消癥方藥物組成：黃芪30 g、黃蜀葵花30 g、熟大黃3 g、黃芩10 g、水蛭5 g、土鼈蟲10 g，購自北京中醫藥大學東直門醫院中藥庫，中藥煎煮後水浴濃縮為1 g/ml，4 ℃冷藏備用，水煎煮和濃縮程序按照《中國藥典》2010版規定執行。采用體表面積系數換算大鼠灌胃給藥劑量，以成年人70 kg，大鼠200 g，換算系數6.3計算[17]，中藥濃度為7.92 g·kg-1·d-1。

30隻大鼠适應性喂養3 d後，随機分為假手術組（NC組，n=10）和模型組（n=20）。在NC組大鼠右腎體表解剖位置，做長約1 cm的橫行切口并縫合。模型組大鼠予右側腎切除，1周後觀察傷口愈合後，腹腔注射STZ造模。55 mg STZ溶解于檸檬酸緩沖液中，配置成1%的STZ溶液。根據參考文獻[18,19]的方法，将模型組20隻大鼠禁食不禁水12 h後，單次腹腔注射STZ（55 mg/kg）構建DKD模型。NC組大鼠注射等體積檸檬酸緩沖液。3 d後測定模型組大鼠尾靜脈血糖，留取DKD模型大鼠24 h尿液，若随機血糖>16.7 mmol/L，24 h尿蛋白定量>30 mg/L，則表明DKD模型建立成功。

将模型組大鼠随機分為DKD亞組和清熱消癥方亞組（QRXZF亞組），每組10隻。NC組和DKD亞組大鼠灌服等量（1 ml/100 g）0.9%氯化鈉溶液，1次/d。QRXZF亞組大鼠以7.92 g/kg的劑量進行中藥灌胃，1次/d。幹預期為16周。

幹預期間每周測量各組大鼠體質量。幹預16周末次給藥後，測量大鼠體質量，收集大鼠24 h尿液記錄尿量，離心轉速為3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，4 ℃離心10 min後，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定大鼠尿微量白蛋白，根據尿量計算大鼠24 h尿微量白蛋白。打開大鼠腹腔，腹主動脈取血，離心條件同前，離心10 min後，取上層血清，全自動生化分析儀測量各組大鼠血肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）和血清白蛋白（ALB）；摘取腎髒并稱量腎髒重量，各組大鼠隻留取左腎作為标本，腎重指數=腎髒重量/體質量×1 000。腎組織石蠟包埋，切成厚度2 μm的切片備用。

HE染色具體步驟如下：（1）腎組織石蠟切片于60 ℃烤片機烤片1 h，新鮮二甲苯Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ脫蠟3次，10 min/次。（2）100%、95%、80%、75%梯度乙醇水化各3 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，5 min/次。（3）蘇木素染細胞核5 min，自來水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來水沖洗15 min，返藍。（4）伊紅染色8 min，95%、95%、100%、100%梯度乙醇脫水各3 min。（5）二甲苯Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ各透明1次，10 min/次。中性樹膠封固，通風櫥晾幹後，在光鏡下對腎髒組織切片進行觀察和分析。

PAS染色具體步驟如下：（1）腎組織常規烤片、脫蠟、水化同上，雙蒸水浸洗2次，5 min/次。（2）滴加氧化劑室溫反應8 min。自來水沖洗1次，蒸餾水浸洗2次。（3）滴加Schiff染液，避光浸染20 min。自來水沖洗10 min。蘇木素染核2 min。酸性分化液分化2 s。自來水沖洗10 min返藍。脫水、透明同前，樹膠封固。PAS染色後，每張切片随機挑選至少3個200倍視野并采集圖像進行腎小球硬化水平評分。評分标準如下：0分，無硬化症；1分，≤10%的腎小球硬化；2分，>10%，≤25%的腎小球硬化；3分，>25%~50%的腎小球硬化；4分，>50%的腎小球硬化。

Masson染色具體步驟如下：（1）腎組織常規烤片、脫蠟、水化同上，媒染液室溫過夜媒染。（2）次日流水沖洗10 min，滴加天青石藍染色液染色2~3 min，水洗2次，15 s/次。（3）Mayer蘇木素染核3 min，雙蒸水洗2次，10~15 s/次。酸性乙醇分化液分化3 s至組織完全變紅，水洗終止分化，雙蒸水沖洗10 min。（4）麗春紅染色10 min，雙蒸水洗2次，15 s/次。（5）磷钼酸溶液處理約10 min。傾去上液，滴加苯胺藍染色液染色5 min。（6）弱酸溶液洗去苯胺藍後，繼續滴加弱酸處理2 min。（7）脫水、透明、封固同前。每張切片随機挑選至少3個200倍視野并采集圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測腎髒組織藍色膠原纖維面積百分比。

IHC具體步驟如下：（1）腎組織常規烤片、脫蠟和水化。（2）95 ℃的檸檬酸鹽抗原修複液修複20 min。（3）滴加100 μl内源性過氧化物酶阻滞劑，室溫孵育10 min；PBS洗5 min，重複3次。（4）100 μl山羊血清，濕盒中37 ℃封閉30 min。（5）滴加p16（1∶50）和Caspase-3抗體（1∶100），濕盒中4 ℃冰箱孵育過夜。（6）次日恢複室溫20 min，滴加100 μl反應增強液劑，37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，5 min/次。（7）滴加羊抗兔或者羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min後PBS洗滌，方法同上。（8）DAB染色約1 min，用雙蒸水終止反應後，蘇木素染核8 min。脫水、透明、封固同前。每張切片随機挑選至少3個200倍視野并采集圖像。p16和Caspase-3陽性表達通過Image-Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析，檢測累積光密度值（IOD）和陽性面積（Area），取二者比值為表達水平。

（1）腎組織常規烤片、脫蠟和水化。（2）滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K〔碧雲天ST532/ST533蛋白酶K（20 mg/ml），用P0106免疫染色洗滌液或10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4~7.8稀釋1 000倍即為20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K〕，20~37 ℃作用15 min。（3）PBS洗滌3次。在樣品上加50 μl TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次。（4）含DAPI的抗熒光淬滅封固液封片後熒光顯微鏡下觀察。每張切片随機挑選至少3個400倍視野并采集圖像。通過Image J對綠色凋亡細胞和藍色細胞核進行細胞計數，取二者比值的百分數為凋亡率。

采用SPSS 27.0軟件進行數據統計分析，計量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

各組大鼠體質量和腎重指數比較，差異均有統計學意義（P<0.01）；其中DKD亞組、QRXZF亞組體質量均低于NC組，腎重指數均高于NC組（P<0.01）；QRXZF亞組體質量高于DKD亞組、腎重指數低于DKD亞組（P<0.01），差異均有統計學意義，見表1。

各組大鼠24 h尿微量白蛋白、Scr、BUN和ALB比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其中DKD亞組24 h尿微量白蛋白、Scr、BUN水平均高于NC組，ALB水平低于NC組（P<0.01）；QRXZF亞組24 h尿微量白蛋白、BUN水平均高于NC組，ALB水平低于NC組（P<0.01）；QRXZF亞組24 h尿微量白蛋白、Scr、BUN水平均低于DKD亞組，ALB水平高于DKD亞組，差異均有統計學意義（P<0.01），見表2。

HE染色可見：DKD亞組腎小球肥大，系膜細胞及系膜基質增生，腎小管上皮細胞空泡變性；QRXZF亞組大鼠腎髒病理變化程度明顯輕于DKD亞組；NC組大鼠腎小球、腎小管及系膜基質未見明顯病理變化，詳見圖1。

PAS染色可見：NC組大鼠腎小球均勻光滑，腎小管基膜及系膜基質無明顯病理性改變，腎小球血管袢薄，未見腎小球肥大及腎小管管型。DKD亞組大鼠腎組織損傷明顯，腎小球基底膜明顯增厚，系膜細胞及基質增多，部分腎小管出現空泡樣病變，管腔擴張，可見腎間質水腫。QRXZF亞組大鼠腎小球基底膜較NC組輕度增厚，腎小管管腔輕度擴張，系膜細胞增多不明顯，詳見圖1。對PAS染色進行量化評分發現，NC組PAS腎小球硬化評分為（0.68±0.47）分，DKD亞組為（3.36±0.49）分，QRXZF亞組為（1.50±0.51）分，各組PAS腎小球硬化評分比較，差異有統計學意義（F=170.42，P<0.01）；其中DKD亞組和QRXZF亞組PAS腎小球硬化評分高于NC組，QRXZF亞組PAS腎小球硬化評分低于DKD亞組，差異均有統計學意義（P<0.01）。

Masson染色可見：DKD亞組腎小管嚴重萎縮，腎小球、小管及間質出現大量藍色膠原纖維；QRXZF亞組大鼠腎小球及間質存在少量藍色膠原沉積物，腎小管輕度萎縮；NC組大鼠腎小球基底膜、系膜基質均正常，未見間質纖維化，詳見圖1。對各組大鼠腎組織Masson染色陽性區域面積進行定量分析，NC組藍色膠原纖維面積百分比為（11.96±0.42）%，DKD亞組為（25.51±1.42）%，QRXZF亞組為（16.10±0.55）%，各組藍色膠原纖維面積百分比比較，差異有統計學意義（F=1102.28，P<0.01）；其中DKD亞組和QRXZF亞組藍色膠原纖維面積百分比均高于NC組，QRXZF亞組藍色膠原纖維面積百分比低于DKD亞組，差異均有統計學意義（P<0.01）。

NC組大鼠腎組織p16表達水平為（0.12±0.01），DKD亞組大鼠腎組織p16表達水平為（0.42±0.02），QRXZF亞組大鼠腎組織p16表達水平為（0.20±0.01）。三組大鼠腎組織p16表達水平比較，差異有統計學意義（F=2 138.86，P<0.01）；其中DKD亞組、QRXZF亞組腎組織p16表達水平高于NC組，QRXZF亞組腎組織p16表達水平低于DKD亞組，差異均有統計學意義（P<0.01），見圖2。

NC組大鼠腎組織Caspase-3表達水平為（0.10±0.02），DKD亞組大鼠腎組織Caspase-3表達水平為（0.62±0.08），QRXZF亞組大鼠腎組織Caspase-3表達水平為（0.18±0.02）。三組大鼠腎組織Caspase-3表達水平比較，差異有統計學意義（F=913.54，P<0.01）。其中DKD亞組、QRXZF亞組腎組織Caspase-3表達水平高于NC組，QRXZF亞組腎組織Caspase-3表達水平低于DKD亞組，差異均有統計學意義（P<0.01），見圖2。

NC組大鼠腎小管細胞凋亡率為（1.50±0.19）%，DKD亞組大鼠腎小管細胞凋亡率為（12.49±0.83）%，QRXZF亞組大鼠腎小管細胞凋亡率為（5.11±0.75）%。三組大鼠腎小管細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=1 533.96，P<0.01）。其中DKD亞組、QRXZF亞組大鼠腎小管細胞凋亡率高于NC組，QRXZF亞組腎小管細胞凋亡率低于DKD亞組，差異均具有統計學意義（P<0.01），見圖3。

研究證實腎髒細胞衰老和凋亡是DKD發生、發展的重要原因[20]。高糖可導緻腎小球系膜細胞過早衰老[21]，衰老與腎纖維化密切相關。2型糖尿病患者的腎髒近端小管可見大量衰老細胞，其腎小球中p16INK4A表達與蛋白尿水平呈正相關[22]。研究證實，抑制p16可減輕衰老相關的分泌表型SASP（senescence-associated secretory phenotype）的表達[23]，抑制p16等衰老相關因子的表達，改善DKD腎損傷[24,25]。本研究對各組大鼠腎組織進行衰老相關蛋白p16的IHC檢測發現，與NC組相比，DKD亞組和QRXZF亞組p16陽性染色明顯更深，且QRXZF亞組明顯低于DKD亞組。本研究結果發現清熱消癥方可以有效減少DKD大鼠腎組織中p16的表達。

Caspase-3是關鍵的凋亡因子，處于Caspase級聯反應的末端，并被細胞凋亡的内在和外在死亡途徑激活，活化的Caspase-3可降解細胞内結構蛋白和功能蛋白，誘導細胞死亡[26]。細胞凋亡會導緻腎細胞外基質沉積、腎小管上皮細胞肥大以及腎小球膜擴張，直至腎小管間質纖維化和腎小球硬化[27,28]。本研究采用凋亡試劑盒對大鼠腎小管進行凋亡細胞檢測，結果發現，DKD亞組大鼠凋亡細胞率明顯高于NC組和QRXZF亞組。IHC結果顯示，Caspase-3在DKD大鼠腎組織中的陽性面積明顯大于NC組和QRXZF亞組，說明清熱消癥方可以減少腎髒細胞凋亡。

本研究發現清熱消癥方可以降低DKD大鼠24 h尿微量白蛋白水平。在腎功能指标方面，與NC組相比，DKD亞組大鼠Scr和BUN顯著升高，而QRXZF亞組明顯低于DKD亞組，說明清熱消癥方可以促進腎髒代謝，保護DKD大鼠的腎功能。本研究還發現DKD亞組大鼠出現消瘦和腎髒肥大，其體質量低于NC組和QRXZF亞組，而腎重指數則明顯高于其他兩組。因此，筆者認為清熱消癥方可以改善DKD大鼠消瘦狀況，減少腎小球肥大。HE染色發現，DKD亞組大鼠腎髒基底膜增厚，系膜細胞和基質增厚，腎小管擴張等。Masson染色提示，DKD亞組大鼠腎小管和間質藍色膠原沉積較其他兩組更明顯，QRXZF亞組藍色膠原面積較少，說明清熱消癥方可以減少高糖環境引起的膠原沉積，改善腎髒纖維化。PAS染色發現，QRXZF亞組腎小球系膜增厚較DKD亞組程度輕。因此，筆者認為清熱消癥方可以改善腎髒纖維化，保護腎髒病理損傷。

清熱消癥方由黃芪、黃蜀葵花、黃芩、熟大黃、水蛭、土元六味藥組成，全方共奏清熱散結、益氣活血消癥之效。方中黃芪大補元氣，氣旺則推動血行，使瘀血去，絡脈通。方中黃芩瀉火解毒、清熱燥濕，善清陽明胃經之熱，阻斷陽明經熱之源頭。黃蜀葵花味辛，性涼，辛味走竄性強，能散、能行、能開郁結，可宣達三焦之氣機，功善清熱解毒。大黃善瀉下攻積、清熱解毒、活血化瘀，蕩滌胃腸熱邪，瀉濁通腑，破積滞，行瘀血，消癥瘕。水蛭功專破血通經，逐瘀消癥，善化腎絡之瘀血，《神農本草經》雲："主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕積聚，無子，利水道。"土鼈蟲能軟堅散結，消癥瘕積聚。《神農本草經》曰："主心腹寒熱洗洗，血積癥瘕，破堅，下血閉。"研究證實清熱消癥方中多種化學成分具有抗衰老作用和凋亡作用，如黃芪的活性成分黃芪多糖可以通過調控機體免疫，清除自由基及抗脂質過氧化發揮抗衰老作用[29]，黃蜀葵花的有效活性成分槲皮素可以減少DKD患者脂肪和皮膚組織中的p16INK4A和p21CIP1等衰老細胞因子的表達[30]，槲皮素還可以降低高糖刺激的小鼠腎小球系膜細胞中Casapse-3的表達，減少細胞凋亡，拮抗葡萄糖波動引起的腎損傷[31]。

綜上所述，本研究推測清熱消癥方可能通過下調DKD大鼠腎組織中p16和Caspase-3的表達，抑制腎髒細胞衰老和凋亡，改善腎髒病理損傷，延緩DKD進展。

本文無利益沖突。

參考文獻略

本文來源：王玉潔, 王健, 周靜威. 清熱消癥方對糖尿病腎病大鼠腎損傷的保護作用研究[J]. 中國全科醫學, 2022, 25(29): 3678-3685.（點擊文題查看原文）

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