pcr技術的三個步驟及内容?1. 如何有效設計引物，下面我們就來聊聊關于pcr技術的三個步驟及内容?接下來我們就一起去了解一下吧!

pcr技術的三個步驟及内容

1. 如何有效設計引物

（1）使用Oligo或Primer設計引物，在保守區内設計，長度一般在18-27bp，上下遊引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之間不應存在互補序列，避免發夾結構。

2. PCR電泳無擴增條帶

（1）酶失活或在反應體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。

（2）模闆含有雜質。特别是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。

（3）變性溫度是否準确：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模闆變性不徹底。

（4）反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，将反應體系95℃加熱5-10分鐘。

（5）引物變質失效。人工合成的引物是否正确。是否純化，或因儲存條件不當而失活。

（6）引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

（7）DNA凝膠電泳時加入陽性對照，确保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。

3. PCR産物量過少

（1）退火溫度不合适。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

（2）DNA模闆量太少。增加DNA模闆量。

（3）PCR循環數不足。增加反應循環數。

（4）引物量不足。增加體系中引物含量。

（5）延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設置延伸時間。

（6）變性時間過長。變性時間過長會導緻DNA聚合酶失活。

（7）DNA模闆中存在抑制劑。确保DNA模闆幹淨

4. 擴增産物在凝膠中塗布或成片狀條帶彌散

（1）酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。

（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。

（3）MgCl2濃度過高。可适當降低其用量。

（4）模闆量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

（5）引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重複PCR反應。

（6）循環次數過多；增加模闆量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。

（7）退火溫度過低。

（8）電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；

②凝膠沒有凝固好；

③瓊脂糖質量差。

（9）若為PCR試劑盒則可能：

①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；

②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。

（10）降解的陳舊模闆擴增也易産生塗布。

5. 擴增産物出現多條帶（雜帶）

（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

（2）循環的次數過多。适當增加模闆的量，減少循環次數。

（3）酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。

（4）退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。

（5）樣品處理不當。

（6）Mg2 濃度偏高，因适當調整Mg2 使用濃度。

（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。

（8）複制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

（9）反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。确保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。

（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

（11）引物量過多。減少反應體系中引物的用量。

（12）模闆量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。

（13）外源DNA污染。确保操作的潔淨。

6. 陰性對照出現條帶

（1）試劑，槍頭，工作台污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作台進行清潔。

7. 條帶大小與理論不符

（1）污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作台進行清潔。

（2）模闆或引物使用錯誤。查看引物是否會擴增部分條帶和模闆是否正确。

3)基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。

8. 持續出現假性條帶

（1）起始退火溫度太低，或目的擴增産物和非目的産物的T值相差不大。可嘗試适當提高PCR溫度或者設置降落PCR，降低循環數。

9. 菌落PCR檢測有條帶，接種大搖後無條帶

（1）可重新以菌落和菌液為模闆進行PCR對照檢測，因為菌落PCR的假陽性概率還是比較高。如果仍出現上述結果，推測可能是平闆上連接液中的未連接載體的擴增引起的目的條帶，進一步質粒PCR檢測，可證明目的片段是否真正連接成功。

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