傳統發酵技術的應用

課題1 果酒和果醋的制作

【補充知識】發酵

1、概念：利用微生物或其他生物的細胞在有氧或無氧條件下繁殖或積累其代謝産物的過程。

2、類型：

（1）根據是否需要氧氣分為：需氧發酵和厭氧發酵。

（2）根據産生的産物可分為：酒精發酵、乳酸發酵、醋酸發酵等。

一、基礎知識

（一）果酒制作的原理

1．菌種是 酵母菌，屬于真核生物，新陳代謝類型異養兼性厭氧型，

有氧時，進行有氧呼吸，大量繁殖，反應式為：C6H12O6 6H2O 6O2 → 6CO2 12H2O 能量；無氧時，能進行酒精發酵，反應式為：C6H12O6 → 2C2H5OH 2CO2 能量。

2．酵母菌繁殖的最适溫度20℃左右，酒精發酵一般控制在18～25℃。

3．自然發酵過程中，起作用的主要是附着于葡萄皮上的野生型酵母菌。也可以在果汁中加入人工培養的酵母菌。

（二）果醋制作的原理

1．菌種是醋酸菌，屬于原核生物，新陳代謝類型為異養需氧型。隻有在氧氣充足時，才能進行旺盛的生命活動。變酸的酒表面觀察到的菌膜就是醋酸菌在液面大量繁殖形成的。

注意：醋酸菌是原核生物,雖然沒有線粒體,但在它們細胞膜的内側上有許多與有氧呼吸有關的酶,所以可以進行有氧呼吸，另外藍藻和硝化細菌等雖然也是原核生物，但也可以進行有氧呼吸。

2．當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，

當缺少糖源時，醋酸菌将乙醇變為乙醛，再将乙醛變為醋酸，

反應簡式為C2H5OH O2 → CH3COOH H2O。

3．醋酸菌的最适合生長溫度為30～35℃。

4．菌種來源：到生産食醋的工廠或菌種保藏中心購買，或從食醋中分離醋酸菌。

二、實驗設計

1、流程圖

2、裝置：充氣口是在醋酸發酵時連接充氣泵進行充氣用的；

排氣口 是在酒精發酵時用來排出二氧化碳的；排氣口要

通過一個長而彎曲的膠管與瓶身相連接，其目的

是防止空氣中微生物的污染。開口向下的目的是

有利于二氧化碳的排出。·使用該裝置制酒時，應

該關閉充氣口；制醋時，應該充氣口連接氣泵，輸入氧氣。

出料口是用來取樣的。

三、課題延伸

果汁發酵後是否有酒精産生，可以用重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應呈現灰綠色。

K2Cr2O7 3C2H5OH 4H2SO4→3CH3CHO(乙醛） K2SO4 Cr2(SO4)3 7H2O 酸性重鉻酸鉀有強氧化性，更易将酒精氧化，一般用硫酸酸化。生成的硫酸鉻呈灰綠色。

檢測時，先在試管中加入發酵液2mL，再滴入3mol/L的H2SO43滴，振蕩混勻，最後滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴。

【教材答案】

（一）旁欄思考題

1.你認為應該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什麼？

答：應該先沖洗，然後再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機會。

2.你認為應該從哪些方面防止發酵液被污染？

提示：需要從發酵制作的過程進行全面的考慮。例如，榨汁機、發酵裝置要清洗幹淨；每次排氣時隻需擰松瓶蓋、不要完全揭開瓶蓋等。

3.制葡萄酒時，為什麼要将溫度控制在18～25 ℃？制葡萄醋時，為什麼要将溫度控制在30～35 ℃？

答：溫度是酵母菌生長和發酵的重要條件。20 ℃左右最适合酵母菌繁殖。因此需要将溫度控制在其最适溫度範圍内。而醋酸菌是嗜溫菌，最适生長溫度為30～35 ℃，因此要将溫度控制在30～35 ℃。

4.制葡萄醋時，為什麼要适時通過充氣口充氣？

答：醋酸菌是好氧菌，在将酒精變為醋酸時需要氧的參與，因此要适時向發酵液中充氣。

課題2 腐乳的制作

一、基礎知識

腐乳制作的原理

1．腐乳的發酵有多種微生物的協同作用，包括青黴、酵母、曲黴、毛黴等，其中起主要作用的是毛黴，它是一種真核生物，新陳代謝類型是異養需氧型。

2．毛黴等微生物産生的蛋白酶可以将豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可以将脂肪水解成甘油和脂肪酸。

3．現代的腐乳生産是在嚴格的無菌條件下，将優良毛黴菌種直接接種在豆腐上，這樣可以避免其他菌種的污染，保證産品的質量。

4.條件控制： 溫度：控制在15~18°C，，并保持一定的濕度。

二、實驗設計

1、實驗流程

讓豆腐長出毛黴→加鹽腌制→加乳湯裝瓶→密封腌制。

3~5天 8天

【教材答案】

（一）旁欄思考題

1.你能利用所學的生物學知識，解釋豆腐長白毛是怎麼一回事？

答：豆腐上生長的白毛是毛黴的白色菌絲。嚴格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。

2.王緻和為什麼要撒許多鹽，将長毛的豆腐腌起來？

答：鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。

3.我們平常吃的豆腐，哪種适合用來做腐乳？

答：含水量為70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量過高的豆腐制腐乳，不易成形。

4.吃腐乳時，你會發現腐乳外部有一層緻密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對人體有害嗎？它的作用是什麼？

答：“皮”是前期發酵時在豆腐表面上生長的菌絲（匍匐菌絲），它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形。“皮”對人體無害。

課題3 制作泡菜

一、制作原理

1、微生物是乳酸菌 ，其代謝類型是異養厭氧型。乳酸菌是一類能利用可發酵碳水化合物産生大量乳酸的細菌的通稱。這類細菌在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性。所以制作泡菜時的乳酸菌是群落，而不是種群。

2、原理：在無氧條件下，将糖分解為乳酸 （乳酸發酵）

3、分裂方式是二分裂。

二、實驗設計

1．腌制條件

腌制過程中，要注意控制腌制的時間、溫度和食鹽的用量。

溫度過高、食鹽用量不足10％、腌制時間過短，容易造成細菌大量繁殖，亞硝酸鹽含量增加。一般在腌制10天後，亞硝酸鹽的含量開始下降。在腌制後的前6天内，泡菜中的亞硝酸鹽含量就可以達到最高峰。而第9天後泡菜中的亞硝酸鹽含量開始有明顯下降。這可能是由于泡菜在開始腌制時，壇内環境有利于某些細菌的繁殖（包括一些硝酸鹽還原菌），這些細菌可以促進硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。但随着腌制時間的延長，乳酸細菌也大量繁殖，對硝酸鹽還原菌産生一定的抑制作，使其生長繁殖受到影響，造成泡菜中亞硝酸鹽的含量又有所下降。

2.泡菜壇的選擇

泡菜壇本身質地好壞對泡菜與泡菜鹽水有直接影響，故用于泡菜的壇子應經嚴格檢驗，其優劣的區分方法如下：①觀型體:泡菜壇以火候老、釉質好、無裂紋、無砂眼、形體美觀的為佳。②看内壁:将壇壓在水内，看内壁，以無砂眼、無裂紋、無滲水現象的為佳。③視吸水:壇沿摻入清水一半，用廢紙一卷，點燃後放壇内，蓋上壇蓋，能把沿内水吸幹（從壇沿吸入壇蓋内壁）的泡菜壇質量較好，反之則差。④聽聲音:用手擊壇，聽其聲，鋼音的質量則好，空響、砂響、音破的質次。

3.材料

（1） 各種蔬菜均可，一般用白菜、洋白菜、黃瓜、柿子椒、胡蘿蔔、白蘿蔔等。

（2） 添加的調味品，如花椒、八角等。

（3） 白酒。

（4） 食糖和鹽。

4.步驟

（1）各種菜洗淨并切成3～4cm長的小塊。

（2）将泡菜壇洗淨，并用熱水洗壇内壁兩次。

（3）将各種蔬菜、鹽水、及調味品放入壇，混合均勻。如果希望發酵快些，可将蔬菜在開水中浸1分鐘後入壇，再加上一些白酒。

（4）将壇口用水封好，防止外界空氣進入。

（5）泡菜發酵

發酵前期：蔬菜剛入壇時，表面帶入的微生物，主要是以不抗酸的大腸杆菌和酵母菌等較為活躍，它們進行異型乳酸發酵和微弱的酒精發酵産生較多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以氣泡從水槽内放出，逐漸使壇内形成缺氧狀态。

發酵産物中除乳酸外，還有其他，如乙醇、CO2等稱異型乳酸發酵。

發酵中期：由于前期乳酸的積累，pH下降，缺氧狀态的形成，乳酸杆菌活躍進行活躍的同型乳酸發酵，乳酸積累pH達3.5~3.8.大腸杆菌、酵母菌、黴菌等的活動受到抑制。這一期為完全成熟階段，泡菜有酸味且清香品質最好。

發酵産物中隻有乳酸，稱為同型乳酸發酵。

發酵後期：繼續進行乳酸發酵，乳酸積累達1.2％以上時，乳酸杆菌的活性受到抑制，發酵速度逐漸變緩甚至停止。

腌制1周左右即可開壇食用。也可随時加入新鮮蔬菜，不斷取用。

（6）如果加入一些已經腌制過的泡菜汁更好，這相當于接種已經擴增的發酵菌，可減少腌制時間。

【教材答案】

（一）旁欄思考題

1.為什麼含有抗生素的牛奶不能發酵成酸奶？答：酸奶的制作依靠的是乳酸菌的發酵作用。抗生素能夠殺死或抑制乳酸菌的生長，因此含有抗生素的牛奶不能發酵成酸奶。

2.為什麼日常生活中要多吃新鮮蔬菜，不吃存放時間過長、變質的蔬菜？答：有些蔬菜，如小白菜和蘿蔔等，含有豐富的硝酸鹽。當這些蔬菜放置過久發生變質（發黃、腐爛）或者煮熟後存放太久時，蔬菜中的硝酸鹽會被微生物還原成亞硝酸鹽，危害人體健康。

3.為什麼泡菜壇内有時會長一層白膜？你認為這層白膜是怎麼形成的？答：形成白膜是由于産膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厭氧微生物，泡菜發酵液營養豐富，其表面氧氣含量也很豐富，适合酵母菌繁殖。

4.加入白酒有什麼作用？白酒可抑制泡菜表面雜菌的生長，它也是一種調味劑，可增加醇香感。

5.用水封閉壇口起什麼作用？不封閉有什麼結果？水封閉壇口起着使壇内與壇外空氣隔絕的作用，空氣中21％是氧氣，這是最簡易的造成無氧環境的方法。這樣，壇内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌進行乳酸發酵。如不封閉，則會有許多需氧菌生長，蔬菜會腐爛。

6. 乳酸菌除了可以用于制作泡菜，還可以用于牛奶發酵。那麼，在牛奶的發酵過程中會産生亞硝酸鹽嗎？酸奶制作過程中并不需要使用鹽,所以沒有産生亞硝酸鹽。

三、亞硝酸鹽含量的測定

1、測定亞硝酸鹽含量的原理

在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發生重氮化反應後，再與N-1－萘基乙二胺鹽酸鹽結合生成玫瑰紅溶液。将經過反應顯色後的待測樣品與标準液比色，即可計算出樣品中的亞硝酸鹽含量。

2、配制标準液

用移液管吸取0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml、1.50ml亞硝酸鈉溶液，分别置于50ml比色管中，再取1支比色管作為空白對照。并分别加入2.0ml對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5分鐘後，再分别加入1.0ml N-1－萘基乙二胺鹽酸鹽溶液，加蒸餾水至50ml，混勻，觀察亞硝酸鈉溶液顔色的梯度變化,用分光光度計讀數，并繪制标準曲線。

3、測定樣品液中亞硝酸鹽含量

吸取40ml透明澄清的樣品液，轉移到50ml比色管中，将比色管做好标記。按步驟2的方法分别加入對氨基苯磺酸溶液和N-1－萘基乙二胺鹽酸鹽溶液，并定容至50ml，混勻，靜置15分鐘後，觀察樣品顔色的變化，并與标準顯色液比較，用分光光度計讀數，根據标準曲線計算出對應的亞硝酸鈉含量，重複實驗三次，取平均值。

附：分光光度計的原理。

分光光度計采用一個可以産生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而産生特定波長的光源，光線透過測試的樣品後，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

常見考點歸納

1、幾種常用發酵菌種的比較

2、果酒、果醋、腐乳、泡菜制作中所用菌種及控制條件的比較

3、果酒、果醋、腐乳和泡菜制作過程的比較及亞硝酸鹽含量的檢測

例題1．下列有關實驗的叙述，不正确的是

A．果酒、果醋的發酵，需要對發酵原料進行嚴格的滅菌

B．提取雞血細胞中的DNA，需用蒸餾水使細胞吸水漲破

C．觀察細胞中染色體形态的變化，應選擇具有分裂能力的細胞

D．觀察動物細胞中核酸的分布，用鹽酸處理可改變細胞膜通透性

答案A

2.下列實驗準備工作中合理的是

A.為了倒平闆将已凝固的固體培養基加熱熔化

B.為了恢複幹酵母的活力将其用沸水處理

C.為觀察植物有絲分裂準備洋蔥鱗片葉

D.為雙縮脲試劑鑒定蛋白質的實驗準備沸水浴

答案A

3．下列實驗做法不．能達到實驗預期的是

A．用兔成熟紅細胞制備細胞膜和粗提取DNA

B．制作泡菜時向壇蓋邊沿的水槽中注滿清水

C．制作果酒時适時擰松瓶蓋，制作果醋時持續供氧

D．用稀釋塗布平闆法估測某土壤浸出液中活菌數目

答案A

4．下列關于高中生物學實驗的原理、方法或選材的叙述，正确的是

A．制作果醋時，通氧不足或溫度過低會使發酵受影響

B．利用稀釋塗布平闆法對細菌計數時需借助于顯微鏡

C．隻要生物材料中含豐富的葡萄糖和果糖，就可直接用于還原糖的鑒定

D．利用二苯胺試劑鑒定細胞提取物，若産生藍色變化即表明有RNA存在

答案A

5. 制作果酒、果醋和泡菜三個實驗的共同點是

A. 菌種為異養原核生物 B.将原料滅菌後再發酵

C. 保證無氧環境下發酵 D.發酵液最終呈現酸性

答案D

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