蛋白酶廣泛存在于人和動物的消化道中，對蛋白質的消化吸收起着至關重要的作用。豬飼料日糧中蛋白質的含量一般為13％～17％，蛋白質能被消化降解多少将直接影響着動物的生産性能和經濟效益，而蛋白質必需經過蛋白酶降解成短肽或氨基酸後才能被動物利用。一般成年豬能夠分泌足夠的蛋白酶消化蛋白質，但仔豬消化機能尚未發育完全，蛋白酶分泌量不足，在一定程度上影響了其生長速度，所以在仔豬日糧中添加外源蛋白酶不但能補充體内内源酶的不足，而且能激活内源酶的分泌，将蛋白質分解成多肽、寡肽或氨基酸等，因而有利于仔豬對蛋白質的消化分解和吸收利用。

目前雖然已開發出多種蛋白酶制劑，但由于菌種酶活力低、生産成本高，因而有關蛋白酶飼料營養方面有待進一步研究。本實驗從不同地區來源的豬糞樣品中分離産蛋白酶芽孢杆菌，旨在篩選高産蛋白酶菌株，同時也篩選适合作為飼料添加劑的産蛋白酶芽孢杆菌，為臨床上提供産酶益生菌奠定基礎。

一、材料

1 、樣品 分别從河南省各地區采集豬糞便等樣品80份。

2、 培養基 (1) 分離培養基：酪蛋白0.5％／脫脂奶粉0.5％，酵母膏0.2％，瓊脂2％，調pH7.5。(2) 發酵培養基：牛肉膏0.5％，氯化鈉0.5％，蛋白胨0.5％，瓊脂1.5％，調pH7.5。

3 、主要試劑 (1) 微量生化發酵管：葡萄糖、蔗糖等36種發酵管購自杭州天和微生物試劑有限公司；(2) PCR試劑：Taq酶(5U/μl)、DL2000、Goodview、瓊脂糖凝膠：購自北京方寶生物科技有限公司；(3) 引物：參考芽孢杆菌的16S rDNA序列設計一對引物，由上海生物工程有限公司合成。P1：5’-CTGCAGCTA CCGGTCGCCACCATG-3’，P2：5’-GAATTCTTAC TTGTACAGCTCGTCCATG-3’。

二、方法

1 、樣品采集及處理 分别從河南省各地區采集豬糞便80份樣品裝入樣品袋内，4℃保存備用。取樣品約lg加入10ml無菌水中，制成10％的混懸液， 80℃水浴熱處理30min。

2、 産蛋白酶菌株初篩、純化 将處理過的上清稀釋到一定濃度，取200μl塗布于分離培養基，置37℃培養24h，挑選能産生酶解圈的菌落，革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢初步認為是芽孢杆菌的，再進行純化培養。

3 、複篩 取菌液2μl純化的菌液在分離培養基上滴種，置于37℃恒溫培養24h，觀察并測量各菌株酶解圈和菌落直徑，通過比較其比值大小，初步篩選出高産蛋白酶菌株。

4 、蛋白酶活力測定 采用福林酚(Folin)法測定酶的比活力，蛋白酶酶活單位的定義：在一定溫度和pH條件下，lmin水解酪素産生1μg酪氨酸為一個酶活力單(U)。

5 、菌株的生化試驗 将上述篩選的菌株接種到微量發酵管，37℃恒溫培養12h，觀察并記錄實驗結果，以标準枯草芽孢杆菌(B.subtilis ATCC6633)為對照。

6 、16S rDNA的鑒定 根據文獻[4]方法提取芽孢杆菌杆因組，并以此為模闆，反應體系如下：10×PCR buffer 5μl，MgCl2 2.5μl，dNTP（10mM）2μl，上遊引物（10mM）2μl，下遊引物（10mM）2μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.5μl，模闆DNA 1μl，ddH2O 38μl。反應參數：94℃，3min→（94℃，50sec→55℃，90sec→72℃，90sec，30 cycles）→72℃，10min→4℃。取5μl PCR産物于1%瓊脂糖凝膠中電泳觀察結果。

7、 序列分析 将上述PCR産物送至中美泰和生物技術（北京）有限公司測序，然後将所測序列提交到NCBI網站（美國國立生物技術中心網站）進行blast同源性分析。

三、結果

1、菌株初篩結果

通過菌株的菌落特征、顯微特征和酶解圈的大小，初步分離得到86株産蛋白酶的菌株

2、 複篩

通過在分離培養基上滴種，比較酶解圈直徑與菌落直徑的比值大小，初步篩選出高産菌株，

3 、菌株生理生化鑒定

B.A464能氧化利用β-半乳糖苷、阿拉伯糖、甘露糖等，不能利用山梨糖、澱粉、葡萄糖酸鹽等，根據形态特征觀察及生理生化鑒定結果，參照伯傑氏細菌鑒定手冊和常見細菌系統鑒定手冊該菌株基本符合蠟樣芽孢杆菌的主要特征。因此初步鑒定B.A464為蠟樣芽孢杆菌。

4、 16S rDNA鑒定結果

4.1 PCR擴增結果

PCR擴增結果表明，該菌株的16S rDNA序列大小約為1500bp，與預期大小一緻，

4.2 序列測定和序列進化樹分析結果

經測序得16S rDNA序列長度為1463bp，與預期結果一緻。将上述序列提交到美國國立生物信息中心(NCBI)進行Blast，結果見圖3，由圖可知菌株B.A464與蠟樣芽孢杆菌Bacillus cereus(B.cereus)親緣關系最近，同源性比對結果表明該株菌與蠟樣芽孢杆菌(Bacillus cereus 08001)的同源性為99％。

四、讨論一下

蛋白酶能作用于飼料中的主要成分蛋白的一種酶制劑，它在一定程度上可以幫助動物消化、降解飼料中的高分子蛋白質，對提高生産性能将起很大的作用，尤其是在幼齡動物上應用效果更為明顯，已在仔豬、雛雞等的生産性能上取得了良好的效果。

作者：李三棟

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