近日，國際學術期刊《分子細胞》在線發表了中國科學院上海生命科學研究院（營養與健康研究院）常興研究組題為Genetic modulation of RNA splicing with a CRISPR-guided cytidine deaminase的最新研究成果。證明可以利用TAM (Targeted-AID induced mutagenesis)基因編輯，靶向DNA上的RNA剪接順式元件，高效調控RNA剪接，用于研究RNA可變剪接的功能，以及用于人類遺傳疾病的治療。

真核細胞中，RNA剪接是基因表達的重要環節。據估計，超過75％的人類基因具有一種以上的mRNA剪接方式（可變剪接），其中大部分可以翻譯為功能性蛋白質。但相對于基因功能而言，對于可變剪接的生理功能，認識還非常有限，原因主要在于調控内源RNA剪接的實驗手段非常有限。RNA剪接的異常也是許多疾病的直接誘因，估計35~50％的人類疾病由基因剪接異常造成。因此，無論是從學術研究或是臨床應用的角度，都亟需開發出調控RNA剪接的基因編輯新方法。

常興研究組過去開發TAM (Targeted AID-induced mutagenesis)，也就是融合核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白和胞嘧啶脫氨酶AID，并且發現它具有兩個特點。首先，可以在sgRNA靶向的DNA上，将C/G堿基随機向其它堿基突變，可以用于分析腫瘤耐藥性突變及誘導蛋白體外進化等；其次，在偶聯UNG抑制劑UGI後，可以在将sgRNA靶向區域中一個小窗口内（5-6個堿基）的C高效向T突變 (Nature Methods, 2016)。

在這一新研究中，博士研究生袁娟娟和馬雲青首先注意到，98%以上的内含子有保守的GU（内含子開始）和AG（内含子末尾）序列，推測如果可以高效精确地将G突變成A，可以特異性阻斷外顯子識别，調控内源性mRNA的剪切。通過這一策略，利用TAM誘導剪接位點DNA上G>A突變，就可以誘導可變外顯子(alternative exon)及組成性外顯子(constitutive exon)的跳讀 (Exon skipping)；改變可變剪接位點的選擇(Alternative splice site)；調節互斥外顯子的選擇(mutually exclusive exons)；誘導小的内含子的包含 (intron retention)。此外，如果通過TAM将３’剪接位點上遊polypyrimidine track中包含的C向T突變，可以促進下遊外顯子的包含。因此，利用TAM可以成功地實現針對RNA剪接的“loss of function”和”gain of function”調控。

最後，研究人員探索了利用TAM修複杜氏肌營養不良症（DMD）的可行性。DMD是一種緻命的遺傳疾病（發病率男性中1/4000）。其發病原因在于，遺傳突變造成Dystrophin蛋白的完全缺失，引發肌肉萎縮和癱瘓，最終造成心髒或肺功能的衰竭。如果通過外顯子跳讀，能産生内部截短的Dystrophin蛋白，可以達到對DMD的治療效果。因此研究人員構建了DMD病人來源的誘導型多能幹細胞，此病人因為外顯子删除造成Dystrophin蛋白的完全缺失。通過在剪接位點誘導G>A的突變，研究人員實現了目标外顯子的完全跳讀，在所有表達TAM的細胞中恢複了Dystrophin的蛋白表達，修複了心肌細胞的缺陷。

該研究得到科技部、國家自然科學基金委、中科院先導計劃和上海市科委相關項目的資助。

TAM 融合蛋白高效調控外顯子跳讀、互斥外顯子選擇、可變剪接位點選擇和内含子包含

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