免疫組化技術步驟?一.固定、脫水、包埋，下面我們就來聊聊關于免疫組化技術步驟?接下來我們就一起去了解一下吧!

免疫組化技術步驟

一.固定、脫水、包埋

1. 取組織放入4%多聚甲醛裡面固定3-4小時,時間根據标本大小适當調整。
2. 取适當大小組織放入包埋盒中,進行脫水。每個染缸液體體積約200ml,每次脫水可以裝20個包埋盒。依次進入:75%酒精1.5小時、95%酒精1.5小時、95%酒精1小時、無水乙醇1.5小時、無水乙醇1小時、二甲苯一号0.5小時、二甲苯二号0.5小時。打開包埋機,分别開啟冷台,冷點,石蠟槽,組織槽進行工作。然後用鐵飯盒承裝石蠟塊并放入包埋機組織槽中加熱溶解。将脫水後的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中,然後再放入石蠟飯盒一号進行第二遍浸蠟,然後石蠟飯盒二号,進行三次浸蠟。
3. 選大小符合的模具,先調整機器滴蠟的速度,不宜過快防止有氣泡。然後在模具中滴入液體石蠟,然後從飯盒二号中拿出浸後的包埋盒,打開用鑷子取出組織放入模具中。然後用包埋盒的另一半蓋住模具,再滴入少許石蠟後放到冷台上冷卻。按上述步驟繼續包埋下一個蠟塊。

二.切片、制片

1. 打開切片機,固定蠟塊(可提前4度冰箱預冷一下),調整刀片和蠟塊的距離。然後調整切片厚度,先粗切,看到完整的蠟片并且有組織後切換厚度,調整到自己想要切的厚度。用力均勻,右手搖動切片,左手用毛筆接片。如片子打卷,可以用毛筆按着蠟片的邊緣再緩慢切,這樣可以得到相對平整的片子。
2. 用毛筆和鑷子将片子或者帶狀片子托起,放入水槽中展片,水溫在40度左右。然後用防脫片載玻片輕輕撈起,載玻片的邊緣盡量不要觸碰水槽底部,防止底部氣泡上浮殘留在片子上。然後标注切片編号放到烤片機上烤片30分鐘。

三.組織化學染色

1. 室溫脫蠟、水化:二甲苯一号10分鐘、二甲苯二号8分鐘、二甲苯三号8分鐘、無水乙醇5分鐘、90%乙醇3分鐘、80%乙醇3分鐘、70%乙醇3分鐘。蒸餾水3分鐘*3次,PBS3分鐘*3次。
2. 熱抗原修複,換新的切片架,放入水化後的切片。配置抗原修複液(一包檸檬酸鈉粉末配置2升PBS溶液),用鐵飯盒或者鍋加熱煮沸。溫度控制在96-98度。然後将切片放入熱鍋中15分鐘,最後自然冷卻室溫。PBS五分鐘*2次,蒸餾水3分鐘*2次。
3. 免疫組化筆畫圈:取出組織,甩幹水分,可用吸水紙吸幹水珠。用組化筆畫圈圍住組織,圓圈完整。
4. 滅活内源酶活性:将切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過氧化氫(二抗試劑盒中A一滴或者50微升,劑量詳見二抗說明書),室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*3次,蒸餾水水洗三分鐘。
5. 封閉非特異性位點:甩幹水分,吸幹水珠,加山羊血清封閉液(二抗試劑盒B一滴或者50微升),放入濕盒内,室溫10分鐘。
6. 甩掉封閉液,滴加一抗蓋住組織,然後放入濕盒内4攝氏度過夜。(一抗濃度見抗體說明書,提前稀釋後分裝,并在負二十度冰箱保存。每張片子一抗劑量不定,看組織面積大小,xxxxx癌組織一張20微升左右。
7. 第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫複溫30分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水洗滌三分鐘。
8. 甩幹水分,吸幹水珠,滴加二抗(二抗試劑盒C)一滴或者50微升,室溫孵育10分鐘。PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
9. 每張片子滴加一滴或者50微升鍊黴菌抗生物素-過氧化物酶溶液(二抗試劑盒D),室溫孵育10分鐘,PBS三分鐘*三次,蒸餾水水洗三分鐘。
10. 每張片子滴加兩滴或者100微升DAB溶液,顯微鏡下觀察3-10分鐘。染色合适即可終止染色,自來水沖洗。
11. 蘇木素複染,1-2分鐘,細胞核變藍色即可終止,自來水或者PBS沖洗反藍(可用0.5%氨水反藍)。
12. 1%鹽酸酒精分化3秒,自來水沖洗三分鐘。
13. 脫水:70%酒精1分鐘、80%酒精1分鐘、95%酒精2分鐘、無水乙醇4分鐘、二甲苯一号3分鐘、二甲苯二号3分鐘。
14. 涼幹片子後滴加适量中性樹膠封片,蓋上蓋玻片,小心氣泡。晾幹半天即可。顯微鏡下拍照。

更多精彩资讯请关注tft每日頭條，我们将持续为您更新最新资讯!