今天推送的文章是發表在Journal of Bioscience and Bioengineering上的“Role of C-terminal domain in a manganese-catalase from Geobacillus thermopakistaniensis”，通訊作者是來自旁遮普大學生物科學學院的Naeem Rashid。

過氧化氫酶 (EC1.11.1.6) 催化過氧化氫分子分解為水和氧氣，是工業上重要的酶，可應用于造紙、紡織、醫療和食品工業。根據序列和結構，過氧化氫酶主要分為三種類型。其中兩種由血紅素過氧化氫酶組成，包括單功能過氧化氫酶或雙功能過氧化氫酶過氧化物酶，而第三組包括在其活性位點含有錳而非血紅素的非血紅素錳過氧化氫酶。血紅素過氧化氫酶是最普遍和充分表征的，而錳過氧化氫酶尚未得到廣泛研究。已在細菌和古細菌中發現錳過氧化氫酶，但在真核生物中未發現。它們在功能上與血紅素過氧化氫酶相似，但在結構上卻截然不同。大多數錳過氧化氫酶是同六聚體和少數同四聚體。三種可用的晶體結構表明錳過氧化氫酶具有三個不同的結構域，一個N端結構域、一個中心結構域和一個C端結構域。中心結構域包含一個四螺旋束，這是所有錳過氧化氫酶的标志性結構基序，包含雙核錳複合物和催化核心。與血紅素過氧化氫酶相比，這種四螺旋束結構賦予錳過氧化氫酶額外的結構穩定性。

在作者之前的研究中，報告了在大腸杆菌中異源産生兩種錳過氧化氫酶Cat_Gt和Cat-II_Gt，它們來自嗜熱、好氧和革蘭氏陽性細菌Geobacillusthermopakistaniensis。表征研究表明，盡管Cat_Gt和Cat-II_Gt都是來自同一生物體的錳過氧化氫酶，但它們的結構和性質表現出顯著差異。Cat_Gt是兩種蛋白質中較大的一種，與Cat-II_Gt相比，活性較低且熱穩定性更高。兩種蛋白質之間值得注意的結構差異是Cat_Gt中的擴展C末端。考慮到兩種酶的特性差異，有必要探讨C末端結構域的作用。該研究描述了Cat_Gt的C末端結構域的缺失及其對截短酶特性的影響。

Cat_Gt-ΔC的設計。Cat_Gt的C末端截短産生Cat_Gt-ΔC，一種具有214個氨基酸殘基的多肽，理論分子量為23,925 Da。截斷區域主要包含無規卷曲以及極少數的β-折疊或α-螺旋。其設計考慮了Cat-II_Gt和基于T. thermopHilus錳過氧化氫酶的結構的域邊界。Cat_Gt-ΔC中包含C端結構域的幾個氨基酸，因為Cat-II_Gt包含以VF結尾的C端結構域的八個氨基酸。因此，在Cat_Gt-ΔC中做出了類似的結尾（圖1）。

圖1

Cat_Gt和Cat_Gt-ΔC的分子模型。Cat_Gt的三維同源模型預測2 Mn² 與酶的每個單體結合（圖2A）。該結構主要由α-螺旋和C-和N-末端延伸的無序尾組成。Ramachandran圖顯示96.3% (286/297) 的氨基酸殘基位于偏好區域。僅發現一個異常值（Gly88），99.7%（296/297）殘基存在于允許區域。與Cat_Gt相似，預測的Cat_Gt-ΔC三維同源模型也顯示2個Mn² 與四螺旋束核心内的每個單體結合（圖2B）。這表明缺少 C 端可能不會影響金屬結合。Ramachandran 圖顯示98.1% (208/212)的殘基位于有利區域。另一種過氧化氫酶Cat-II_Gt已從 G. thermopakistaniensis中表征。盡管這種酶與全長Cat_Gt僅具有23%的序列同一性，但它們的結構在核心結構區域非常相似（圖2C）。這兩種結構疊加的RMSD為 1.29 Å。盡管四螺旋束在兩種結構中都很好地對齊，但兩種蛋白質之間值得注意的結構差異是Cat_Gt中的擴展C末端，而Cat-II_Gt中不存在。當将Cat_Gt-ΔC與Cat-II_Gt進行比較時，RMSD為1.26 Å （圖 2D）。Cat_Gt的C末端結構域的截斷使氫鍵和鹽橋的數量分别從22和26個減少到Cat_Gt-ΔC中的15個和5個。

圖2

Cat_Gt和Cat_Gt-ΔC中的金屬結合位點。在Cat_Gt-ΔC中與Cat_Gt相同的位點發現了兩個Mn² ，因為保守的錳結合殘基存在于包含四螺旋束的中央結構域中，因此不受 C 端截斷的影響（圖1和3）。發現兩個 Mn² 參與與三個谷氨酸殘基Glu37 、GluGlu71 、GluGlu¹⁵¹；兩個組氨酸殘基，His74 和 His His¹⁸⁴；和Thr40 、TyrTyr44 、LysLys¹⁵⁸和Leu¹⁷⁷的配位（圖3）。發現這兩個Glu和His殘基在先前已表征的所有錳過氧化氫酶中都是保守的。在Cat_Gt-ΔC中，沒有發現與Cat_Gt相似的Ca² 配位位點。這使得這些蛋白質不同于來自同一生物體的其他錳過氧化氫酶Cat-II_Gt，據報道，Ca² 的作用是穩定同源六聚體複合物。金屬含量分析也驗證了Cat_Gt-ΔC的每個亞基有~2 Mn² ，而沒有檢測到Ca² 。

圖3

Cat_Gt和Cat_Gt-ΔC中的底物結合位點。分子對接結果顯示過氧化氫與 CatGt 相互作用在三個不同的結合位點。有人提出，過氧化氫在三個位點中的兩個位點的結合似乎是變構的，具有最小可能的結合能。這些位點存在于蛋白質表面，與這些位點結合的過氧化氫可能會誘導一些構象變化，從而允許底物進入酶活性位點。由于Cat_Gt的長柔韌 C 末端尾部在四螺旋束上組織松散，因此假設尾部可能會阻止過氧化氫直接進入位于四螺旋束核心内的酶活性位點。過氧化氫以較低的親和力和較高的解離常數與酶活性位點結合。在這裡，過氧化氫的結合也通過其與酶活性位點峽谷中存在的Mn² 的相互作用而穩定。過氧化氫與Glu37 、GluGlu71 、HisHis74 、GluGlu¹⁵¹和 His¹⁸⁴形成氫鍵，而 Thr40 、LysLys¹⁵⁸、Arg¹⁸⁰和 Gly¹⁸¹通過疏水相互作用穩定結合（圖4A）。過氧化氫還與酶活性位點中的Mn² 形成共價鍵和氫鍵。這種酶中的Lys¹⁵⁸似乎是T. thermophilus中錳過氧化氫酶中催化殘基Lys¹⁶²的替代品。在酶的周轉過程中，這種 Lys被提議用于将過氧化質子轉移和偶聯到活性位點殘基和錳氧化還原中心。在Cat_Gt-ΔC模型中，與Cat_Gt相比，過氧化氫以相對較高的親和力、更高的特異性和更低的解離常數結合。過氧化氫的結合能為約3.63 kcal/mol，而解離常數為 5.08 mM。過氧化氫的結合通過其與酶活性位點峽谷中存在的Mn² 的相互作用而得以穩定（圖4B）。與Cat_Gt相比，Cat_Gt-ΔC中的非特異性底物結合需要相當高的解離常數和結合能。

圖4

重組Cat_Gt-ΔC的生産。Cat_Gt-ΔC基因在大腸杆菌中的表達導緻重組蛋白 (~24 kDa) 的産生，主要是不溶性和無活性形式。表達條件的變化，包括培養溫度、IPTG 的誘導濃度和生長培養基中 Mn² 的補充，在重組Cat_Gt-ΔC的可溶性生産中仍然不成功。此外，在誘導之前通過冷或熱休克激活宿主伴侶蛋白是不成功的。最後，在體外用尿素溶解Cat_Gt-ΔC包涵體，随後在2 mM Mn² 存在下通過分級透析進行再折疊，成功地獲得了可溶性和活性重組蛋白。在重新折疊過程中，Mn² 的補充促進了酶的正确折疊和apo形式向holo形式的轉化。這種方法導緻以可溶和活性形式回收近25% 的最初使用的不溶性蛋白質。從1L細菌培養物中獲得近45 mg可溶性重組Cat_Gt-ΔC，從~2850 mg細胞（濕重）産生~180 mg包涵體。當通過凝膠過濾色譜法測定Cat_Gt和Cat_Gt-ΔC的分子量時，發現Cat_Gt在溶液中以四聚體形式存在，Cat_Gt-ΔC在溶液中以單體形式存在。

表1

pH、溫度和金屬離子對過氧化氫酶活性的影響。Cat_Gt-ΔC的最适pH值與Cat_Gt相似，在pH 7.0~7.5 的磷酸鈉緩沖液（圖7A）中發現最高活性。同樣，重組Cat_Gt的最适溫度為60℃沒有變化。當比較Cat_Gt和Cat_Gt-ΔC在80和100 ℃時的熱穩定性時。Cat_Gt-ΔC的半衰期為80 ℃ 4.5小時和100 ℃ 20分鐘（圖7C），而 Cat_Gt的半衰期為 80 ℃ 8 小時和 100 ℃ 1小時（表1）。這些結果表明，可能由于相關的結構變化，C-末端截短降低了蛋白質的熱穩定性。在與1 mM EDTA孵育或将其添加到測定混合物中後，觀察到Cat_Gt-ΔC的過氧化氫酶活性顯著降低。當在各種金屬離子（100 mM）存在下進行活性測定時，在Mn² 存在下活性增加了兩倍以上（圖 8A）。當在不同濃度的Mn² 存在下檢查重組Cat_Gt-ΔC的過氧化氫酶活性時，與不含額外金屬離子的對照樣品相比，2 mM Mn² 的活性增加了十倍以上（圖 8B）。Cat_Gt-ΔC的底物特異性和催化活性與Cat_Gt沒有顯著差異。Cat_Gt和Cat_Gt-ΔC的動力學參數比較見表1。從數據可以看出，Cat_Gt-ΔC表現出比Cat_Gt更低的K_m值和更高的催化效率。

圖7

圖8

綜上，删除C末端結構域會消除非特異性結合，從而提高底物親和力。Cat_Gt和Cat_Gt-ΔC的最适pH、最适溫度和底物特異性無顯著差異。然而，K_m值從259降低到157 mM，與Cat_Gt相比，Cat_Gt-ΔC的催化效率提高了1.5倍。此外，去除C末端結構域将四聚體性質轉化為單體，并降低了截短蛋白質的熱穩定性。這些結果表明，Cat_Gt的C末端結構域可能在維持酶功能方面幾乎沒有作用，但為蛋白質提供了額外的結構穩定性，這是工業應用所需的特性。

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文章信息：

PMID: 35811183

DOI: 10.1016/j.jbiosc.2022.06.010

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