一、實驗目的

ü 了解蛋白質的基本結構單位及主要連接方式

ü 了解蛋白質和某些氨基酸的呈色反應原理

ü 學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法

二、實驗原理

v 雙縮脲反應

Ø 兩分子尿素加熱到180℃左右時，生成雙縮脲并放出一分子氮，雙縮脲在堿性環境中能與Cu2 結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應

Ø 蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發生此反應，因此該反應可用于蛋白質的定性或定量測定

v 茚三酮反應

Ø 所有的α-氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質，除了脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反應産生黃色物質

Ø 該反應十分靈敏，是一種常用的氨基酸定量測定方法

Ø 該反應分為兩步：第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮結合另一分子水合茚三酮和氨縮合生成有色物質

v 黃色反應（Pauly反應）

Ø 含有苯環結構的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸後，可被硝化成黃色物質，該化合物在堿性溶液中進一步形成深橙色的硝醌酸鈉

Ø 多數蛋白質分子含有帶苯環的氨基酸，所以有黃色反應，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應

v 考馬斯亮藍反應

Ø 考馬斯亮藍G-250具有紅色和藍色兩種色調，在酸性溶液中其以遊離态存在，呈棕紅色；當它與蛋白質通過疏水作用結合後變為藍色

Ø 考馬斯亮藍G-250染色靈敏度比氨基黑高3倍，反應速度快，約在2min左右時間内達到平衡，室溫1h内保持穩定

Ø 在0.01～1.0mg蛋白質範圍内，蛋白質濃度與A595nm值成正比，所以常用來測定蛋白質的含量

三、實驗器材

Ø 試管及試管架，試管夾，酒精燈，滴管，電爐，濾紙

四、實驗材料與試劑

Ø 尿素，10％NaOH溶液，1％CuSO4溶液，2％卵清蛋白溶液，0.5％甘氨酸溶液，0.1％茚三酮水溶液，0.1％茚三酮乙醇溶液，雞蛋清溶液，頭發，指甲，0.5％苯酚溶液，濃硝酸，0.3％色氨酸溶液，0.3％酪氨酸溶液，考馬斯亮藍G-250溶液

五、實驗操作

v 雙縮脲反應

Ø 取少量尿素結晶，放入幹燥的試管，微火加熱使尿素熔化，熔化的尿素開始硬化時停止加熱，尿素放出氮，形成雙縮脲

Ø 冷卻後，加入1mL 10％NaOH溶液，振蕩混勻，再加入1滴 1％CuSO4溶液，振蕩，觀察實驗現象

Ø 向另一支試管中加入約1mL 2％卵清蛋白溶液和約2mL 10％NaOH溶液，搖勻，再加入2滴1％CuSO4溶液，随加随搖，觀察實驗現象

v 茚三酮反應

Ø 取2支試管，分别加入2％卵清蛋白溶液和0.5％甘氨酸溶液各1mL，再各加0.5mL 0.1％茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1～2min，觀察實驗現象

Ø 在一塊小濾紙上滴一滴0.5％甘氨酸溶液，風幹後，在原處滴一滴0.1％茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘幹顯色，觀察實驗現象

v 黃色反應（Pauly反應）

Ø 取6支試管，按下表加入各試劑：

Ø 觀察各管的現象，若反應較慢，可略微放置或用微火加熱

Ø 待各管出現黃色後，于室溫下逐滴加入10％NaOH溶液至堿性，觀察顔色變化

v 考馬斯亮藍反應

Ø 取2支試管，按下表加入各試劑：

Ø 觀察實驗現象，并解釋

六、實驗思考

Ø 通過本實驗你掌握了幾種鑒定蛋白質和氨基酸的方法？它們的原理是什麼？

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