1．試驗原理　　

真空冷凍幹燥保藏法是兼具低溫、幹燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都适用，不宜用凍幹法保存的微生物不到2%。冷凍幹燥法是在低溫下快速将細胞凍結，然後在真空條件下幹燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細胞的損害，要采用保護劑來制備細胞懸液，使菌在凍結和脫水過程中起到保護作用的溶質，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所産生的親和力來穩定細胞成分的構型。即是使樣品中的水分在冰凍狀态下，抽真空減壓，使凍結的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到幹燥。幹燥後的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。　

2．試驗步驟　　

1）安瓿管準備

選取規格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘幹；在每管内放入打好菌号及日期的标簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。　　

2）保護劑的選擇及制備

冷凍幹燥保藏法使用的保護劑種類很多，效果不盡相同，通常采用高分子化合物與低分子化合物混合使用效果更好。在配制時注意比例、濃度、pH和滅菌方法。一些對熱敏感的保護劑如血清等用過濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數菌種可以用脫脂乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數菌種可以用脫乳為保護劑。 　　

3）菌種準備及分裝

菌種要求為生長良好的純種，菌齡以處于穩定期為好，孢子是新鮮的。每支長好的斜面加2～3ml保護劑，用接種環将菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養基)，制成菌懸液。如用液體培養的菌種，則需經離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細胞，收集的菌體用保護劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數要求達到10 8～10 10cfu/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結。分裝安瓿時可用滅菌的長滴入安瓿管底部，裝量可依據冷凍幹燥機效能而定。 　　

4）預凍

分裝好的安瓿管需要進行預凍，即放在-30～-40℃下凍結20～60min，也可以用幹冰和無水乙醇凍5～10min。　

5）冷凍幹燥

經預凍的安瓿放入幹燥箱中開始抽真空幹燥。此時幹燥箱溫度控制在-30℃以下，并盡快使真度達到66Pa以下。此後可還漸升溫以加速水分升華，但升溫不宜過快，以免引起樣品融化。幹燥時間視凍幹機效率、樣品裝量及性質等而定，以樣品最終水分含量達到1%～3%為準。具體操作時是根據凍幹樣品呈酥塊工松散片狀；真空度接近空載時最高真空；樣品溫度與管外溫度接近。 幹燥完畢将安瓿管在真空下用火焰燒熔密封，并用高頻真空檢測真空度。　

6）保藏及凍幹管的啟用

密封好的凍幹管在4℃或-18℃下保藏。當需用凍幹菌種時，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無菌條件下打開，或将安瓿頂部在酒精燈火焰上灼燒，迅速滴上冷的無菌水，使管破裂，然後用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.3～0.5ml液體培養基溶解凍幹菌塊成為懸液，用無菌滴管或接種環移至斜面或液體培養基進行培養。　　

7）影響菌株生長因素　　

①菌的質量：保藏的菌種應培養在營養豐富的最适條件下，使之進入穩定期，稍老一些的菌體對環境抵抗力強。另處，作為冷凍幹燥的菌懸液細胞濃度要高不同的菌對冷凍幹燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細胞濃度不高，就會使以後傳種造成困難，保存期也會受到影響。

②保護劑：不同種類的保護劑對不同微生物的作用是不同的，如個别菌種在脫脂乳作保護劑的情況下死亡率高達99.99%，而采用葡聚糖等混和保護劑時死亡率大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對保護劑的要求不很嚴格，而不易保存的菌種對保護劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護劑是冷凍幹燥保存菌種的關鍵因素。　

③幹燥速度：實驗表明，慢速幹燥比快速幹燥存活率高，如青黴菌6h幹燥存活率為67.3%，而3h為59%。

④空氣的影響：冷凍幹燥後空氣對細菌細胞影響較大，可導緻細胞損傷進而死亡，故在凍幹後應立即在真空下融封，才有利于長期保存。

⑤溫度的影響 在幹燥和真空狀況下溫度的影響遠沒有上述幾項因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。

⑥含水量的影響：水分含量過高對菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把幹燥後的細胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。

⑦複蘇培養：打開安瓿管後加入無菌水使 凍幹菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。　

菌種能否适宜于凍幹保存，需經過實驗來證明，一般是在保存1個月進行複蘇培養，如果菌的成活率高于10%，即認為可用凍幹保存法保存，以後6個月、2年、5年、10年再進行檢查存活情況，以确定保存期的上限。凍幹保藏的效果因微生物種類而異，一般是細菌＞放線菌＞真菌＞藻類，而菌絲體不宜用此法保存。　　

3．試驗效果

冷凍幹燥保存的菌種存活時間長、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發生變異。還具有體積小、不易污染、便于運輸等優點，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。　　

4．試驗儀器及試劑

冷凍幹燥備有不同型号和類型，但都由四個部分組成：幹燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統。幹燥箱可控制溫度範圍為-40～40℃。

更多精彩资讯请关注tft每日頭條，我们将持续为您更新最新资讯!