ELISA素來以靈敏度較高、特異性較好的特點在臨床上得到了廣泛的應用。而它作為經典的免疫檢測方法，雖然看似平常但是要真正将該實驗做好并不容易，酶标闆的讀值總是會不盡如人意，可見實操中的各個環節對該實驗的檢測效果影響較大，如不注意，就會産生一些糟心的實驗結果。

問題1低信号強度

如果ELISA讀數低于吸光度下限（<000），且目标樣本濃度超出标準曲線範圍，則進行分析的樣本濃度可能太低，或者儀器所能分析的樣本檢測最佳條件可能未被滿足。在這種情況下，樣本所産生的檢測信号應該需要被級聯放大。

解決方案：

1.增加抗體的孵育時間。如果依照protocol在室溫下孵育您的抗體2小時後的實驗結果并不理想，那麼可以嘗試在4°C孵育過夜。如此，可允許抗原抗體最大程度上的結合，并能擴大ELISA中的反應信号。

2.增加二抗-酶結合物的濃度。ELISA中的E代表酶（通常是辣根過氧化物酶，HRP），它與底物（通常是TMB）反應後可産生鮮豔的藍色。因而，将HRP濃度提高50％或将其加倍，則會産生更強的顔色，易于檢測。

3.充分避光，以保護TMB基質不受光照影響，并确保其能最大限度地發揮其性能。考慮到TMB對光線非常敏感，因而在黑暗中進行ELISA平闆的顯色反應會産生更強的信号。

問題2高背景

ELISA闆上的空白孔通常被用作為陰性對照，當該組中任意孔的讀數明顯大于0，這均表示實驗背景有問題。

解決方案：

1.室溫過高，可能會導緻實驗結果偏高。因而，如果發現所有的實驗孔的讀數均偏高，請注意控制恒溫箱溫度，盡可能将其穩定在37℃左右。

2.平闆孔内因清洗不徹底，而導緻有酶或底物殘留，同樣會産生高背景。此時需要按照protocol對ELISA平闆進行清洗，可不任意減少洗闆液的體積以及洗闆次數，同時也需要按要求操作，并适當延長清洗液浸泡孔的時間。

3.加樣或加酶時導緻了陰性孔的污染。此時需要及時更換吸頭以避免造成污染，切忌僥幸心理。

4.試劑過期或被污染。實驗操作過程中不要使用過期試劑，并防止組分污染。如使用容器時，應注意容器的清潔。

問題3重複性不好

同一個樣本間的各個複孔的讀數有顯著性差異。

解決方案：

1.加樣量多少不一，操作時間長短不一。重複同一樣本時，加樣量與加樣時間理應相同，同時也應注意移液器的校準。加樣後可輕微晃動酶标闆使反應液充分混合。

2.樣本應保證一緻、無污染，并應該由同一名操作人員進行操作。

3.精密度測定方法不标準，此時理應采用正确的方法進行操作。

問題4幹擾

幹擾物質如清洗劑或NADH（存在于血清中）可能會影響ELISA平闆的吸光度讀數并使得實驗結果偏離真實結果。

解決方案：

1.嚴格按照protocol進行實驗操作。通常protocol中會指出會對實驗産生幹擾的化學物質，以及會告知實驗者如何避免它們。比如在進行血紅蛋白幹擾的血清測定中，通常會建議不要使用溶血的血清樣品。

2.有時可能你也别無選擇，隻能使用含有幹擾物質的樣品。如果你感興趣的抗原濃度較高，可以使用一個濃度較低但仍易于檢測的樣品稀釋液，如此可以稀釋樣本中的幹擾物質并降低其對實驗的幹擾。

問題5陽性與陰性不能達到2.1的比值

陰性顔色太深，又或者陽性顔色太淺。

解決方案：

1.當陰性顔色太深時，則陰性對照（也就是陽性對照的除目标抗原外的其它成分）中可能有某種成分與一抗作用。此時可通過純化抗原除去幹擾成分。

2.當陽性顔色太淺時，原因可能有3個：一抗效價不好，換用一抗或增加一抗用量；抗原太稀，增加抗原濃度；封閉時間過長，應縮短封閉時間，封閉時間一般37攝氏度2個小時，或者4攝氏度過夜。

問題6增加抗原濃度，一抗濃度不變，顯色反應沒有表現出應有的梯度

一抗與抗原的比例已經飽和。

解決方案：

增加一抗用量; 或在一抗用量不變的情況下減少抗原濃度做梯度。

問題7增加一抗濃度，抗原濃度不變，顯色反應沒有表現出應有的梯度

增加抗原用量；或在抗原用量不變的情況下減少一抗濃度做梯度。

問題8加完TMB顯色後顔色梯度很明顯，但加了硫酸終止反應後顔色梯度沒有那麼明顯了

硫酸可能把其它成分都炭化了

解決方案：

加少一點硫酸，參考值：50 μlTMB 35 μl硫酸；或者采用1M的HCL作為終止液，50ulTMB 50ul1M HCL。

參考文獻：Troubleshooting a Faulty ELISA

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