行業展望

我國農作物種業市場規模逐年增長，其中以糧食作物種子市場規模較大。目前我國育種産業發展仍處于初級階段，存在龍頭企業市場占有率和行業集中度不高、企業育種技術和水平落後于發達國家、種企研發投入不足等問題。雖然基因編輯技術的出現有望改變這種局面，但我國在基因編輯農作物研發方面處于國際領先水平，産業化卻處于落後的局面。

2022年1月24日，我國農業農村部印發了《農業用基因編輯植物安全評價指南（試行）》，針對未引入外源基因的基因編輯植物制定了新的評價指南。該指南對我國國内的基因編輯植物和轉基因植物進行了區分，這無疑将極大促進合成生物技術在農業領域更好地應用和發展，不涉外源基因的改造植物或将放寬。該指南的發布标志着我國基因編輯育種技術的産業化将逐漸步入正軌。

未來加大種業研發創新、加強生物育種技術應用和加快優質品種商業化推廣進程将是大勢所趨。在後期發展中，國家政策對育種産業的支持力度有望不斷加大，同時以基因編輯為代表的技術應用将成為推動我國種業市場規模增長的主要動力。在傳統育種方面，我們與發達國家的差距較大，但基于基因編輯的育種産業我們處于跟蹤國際、尋機趕超的階段，很有可能實現彎道超車。

性狀訂制舉例

基因編輯育種技術的優勢之一是它可以加速品種改良（圖1），同時該技術可得到無任何外源基因序列整合但基因組卻被編輯過的植株（圖2），相當于自然條件下得到的突變體。

圖1 基于生物技術發展的四種育種技術 (Gao et al., 2021)。基于自然發生的突變被用于将各種優良性狀引入受體材料（8-10年）。突變育種（8-10年）用于在全基因組引入随機突變，極大地拓展了遺傳變異。雜交和突變育種通常需要很長時間。轉基因育種（8-12年）可以用來引入其他生物的基因或性狀，但外源DNA會随機整合到植物基因組中，而轉基因作物的商業化需要經過漫長的監管及評估過程。基因編輯技術可用于編輯植物的基因組，最終可得到無外源DNA的植株。基于基因編輯的育種技術（2-5年）被稱為5G育種技術。

圖2 分離無轉基因成分（transgene-free）植株的策略 (Gu et al., 2021)。（A）通過遺傳分離消除轉基因序列，CRISPR/Cas DNA（紅色雙鍊）通過農杆菌或粒子轟擊遞送進入植物細胞。檢測轉基因陽性植株，再通過檢測靶位點基因型篩選基因編輯植株，此後經過自交可分離出無轉基因成分的基因編輯植株；（B）通過農杆菌或粒子轟擊，将CRISPR/Cas DNA序列瞬時遞送進入植物細胞，通過PCR從所有再生幼苗中分離出無轉基因成分的基因編輯植株；若使用Hi-Edit策略，選擇單倍體後代并檢測靶位點基因型，再對單倍體編輯植株進行染色體加倍，得到無轉基因成分的純合基因編輯植株；（C）将CRISPR/Cas RNA或RNPs遞送進入植物細胞，通過檢測靶位點基因型分離出無轉基因成分的基因編輯植株。

下面大家就和伯小遠一起去看看有哪些基礎研究将來可能會應用于育種中吧（圖3）！

圖3 基于CRISPR的基因編輯系統在植物育種中的應用 (Ahmad et al., 2021)。（a）誘導雄性不育系，通過編輯TMS5開發出的雄性不育系可為兩系雜交水稻系統節省時間和成本；（b）固定雜交優勢，在MiMe材料中編輯MTL基因可生産雜交水稻種子；（c）誘導單倍體，例如，在水稻中，編輯MTL、DMP或CENH3可生産單倍體誘導系；（d）開發适應氣候變化的品種，編輯Su-/Se-基因可以生産可抵抗各種環境脅迫的品種；（e）從頭馴化，同時編輯與不同性狀有關的多個基因可以更快、更有效地馴化野生作物；（f）基因聚合，通過同源定向修複（HDR）在一條染色體上聚合多個有益的基因；（g）克服自交不親和，通過敲除控制自交不親和的S-RNase基因解決馬鈴薯自交不親和的問題；（h）染色體易位，基于異源末端連接（NHEJ）的染色體工程可以幫助作物提高産量等；（i）促進種間交叉相容，通常種間是無法雜交的，但CRISPR編輯技術可用于打破這些障礙；（j）新物種形成，例如，MiMe材料會産生2n配子，自交（2n 2n=4n）或與野生型回交（2n 1n=3n）後，可以産生新物種，這對于無性繁殖的園藝作物非常重要。

基因編輯技術給了我們太多的想象（圖3），對育種來說，我們的目的無非是讓作物更高産、更營養、更抗病。因此，可以用來做性狀訂制的基因實在太多啦，小遠就選一個育種家比較關心的抗除草劑性狀，來分享一下這方面的知識吧。

目前世界糧食累計産量約為21億公噸，糧食總産量損失約為2億公噸，其中10%的損失是雜草造成的 (Hussain et al., 2021)。在現代農業系統中，使用除草劑是控制雜草的主要策略，但除草劑不僅會破壞雜草，也會影響農作物，所以育種家開始培育抗除草劑作物 (Shah et al., 1986)（圖4），盡管轉基因育種是成功的，但它存在監管問題，基于基因編輯技術開發抗除草劑品種是目前轉基因抗除草劑育種和常規抗除草劑育種的替代選擇。

圖4 世界首例抗除草劑轉基因植物于1986年報道。除草劑草甘膦是EPSP合酶的有效抑制劑，過表達EPSP合酶基因可實現EPSP合酶的高水平表達，使植物對草甘膦具有耐受性。圖片來源：伯遠生物科研繪圖團隊《她的百年沉浮，都與你的轉基因植株有關》。

除草劑種類繁多，作用機制也各有不同，主要可分為兩種類型：i，選擇性/非選擇性除草劑。選擇性除草劑主要基于植物激素起作用，抑制目标雜草的生長，不會影響作物，例如2,4-D、麥草畏、甲氯丙酸。非選擇性除草劑會影響所施用的所有植物，例如草甘膦、草铵膦、百草枯。ii，内吸/接觸性除草劑。内吸性除草劑通過維管組織在整個植株中轉移，比接觸性除草劑需要更長的時間來殺死雜草。接觸性除草劑僅破壞與這些除草劑接觸的植物組織，并不會轉移到整個植株中 (Hussain et al., 2021)。

這裡給大家列舉一些常見的除草劑：

草甘膦：草甘膦是内吸性非選擇性除草劑，是烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶（EPSPS）抑制劑，EPSPS在植物中用于合成芳香族氨基酸。

草铵膦：草铵膦是廣譜接觸性非選擇性除草劑，作用相對較快，通過抑制谷氨酰胺合成酶導緻植物光呼吸受到抑制，同時，它還可以誘導ROS的産生從而導緻細胞快速死亡。

乙酰乳酸合酶（ALS）抑制劑類除草劑：ALS是三種支鍊氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和缬氨酸）合成的第一步關鍵酶，ALS抑制劑會使受影響的植物缺乏這些氨基酸，最終導緻細胞DNA合成受到抑制。ALS抑制劑包括各種磺酰脲類（SU)（如氟嘧磺隆和甲磺隆）、咪唑啉酮類（IMI）、三唑并嘧啶類（TP）、嘧啶基苯甲酸酯（POB）和磺酰氨基羰基三唑啉酮（SCT）。ALS生物途徑僅存在于植物中，因此ALS抑制劑是最安全的除草劑之一。

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑：ACCase參與脂肪酸合成的第一步，ACCase抑制劑影響植物脂肪酸合成從而導緻植物死亡。ACCase抑制劑包括芳氧基苯氧基丙酸酯（APP）、環己二酮（CHD）和苯基吡唑啉（PPZ）。

羟苯基丙酮酸雙加氧酶（HPPD）抑制劑類除草劑：HPPD抑制劑會抑制參與酪氨酸分解的酶，而植物需要利用酪氨酸分解産物制造類胡蘿蔔素來保護葉綠素不被陽光破壞，因此，施加HPPD抑制劑類除草劑會使植物喪失葉綠素，變白直至死亡。

基于基因編輯技術開發抗除草劑品種主要在于靶位點的突變。目前已在雜草中發現了8個變異的ALS基因，這些天然突變賦予了ALS對除草劑的耐受性，涉及到的氨基酸殘基為Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和Gly654，其中氨基酸數是基于拟南芥ALS基因的。雜草獲得ACCase抑制劑耐受性是由于以下7個位置的氨基酸突變；Ile1781、Trp1999、Trp2027、Ile2041、Asp2078、Cys2088和Gly2096。對于EPSPS基因來說，已知在Thr102、Ala103和Pro106處發生的突變使雜草進化出了草甘膦抗性 (Dong et al., 2021)。

下面列舉了抗除草劑靶位點的突變使水稻、玉米、小麥、大豆等作物獲得除草劑耐受性的報道（表1）。篇幅所限，沒有詳細介紹，如果大家感興趣的話，可以給小遠留言，今後再詳細寫一寫啦！

表1 基于CRISPR基因編輯技術開發的抗除草劑植物 (Dong et al., 2021)。表中列舉了靶基因、突變位點、抗性物種、基因組修複方式。

商業化案例

目前各國對基因編輯産品的态度不一，巴西、阿根廷、日本、美國等國家較為寬松，歐盟、墨西哥等态度謹慎，認為基因編輯作物與轉基因作物實質等同。具體可參考下表中各國的農業基因編輯指數。

表2 農業基因編輯指數。下表的基因編輯指數評級代表了各國目前基因編輯法規的狀态。數據來自于Global gene editing regulation tracker。

在這裡先介紹一種被美國農業部（USDA）批準上市的基因編輯大豆，該大豆是通過TALEN介導的基因編輯技術生産的，是美國首個獲批的基因編輯産品，也是為數不多的真正商業化成功的案例，是非常有代表性的，大家可以了解一下喔。

高油酸大豆

成立于2010年，總部位于美國明尼蘇達州的Calyxt公司于2019年推出高油酸大豆，是美國首個獲得商業批準的基因編輯産品。經批準，該基因編輯大豆不受轉基因植物相關法規的制約，其種植和加工無須批準，也無須滿足其他條件。由其生産的大豆油含有80%的油酸、最多含20%的飽和脂肪酸且不含反式脂肪酸，對比普通大豆油中20%的油酸含量并在加工過程中容易産生反式脂肪酸的現象可謂是非常優秀了，而且其油炸使用時間、保質期均比普通大豆油更長。

圖5 由Calyxt公司的高油酸大豆生産的大豆油Calyno。圖片來源：Retail-today。

Calyxt公司通過TALEN介導的基因編輯技術敲除大豆中的FAD2-1A和FAD2-1B兩個基因，檢測為陽性的T0代大豆繼續種植，收獲T1代大豆，得到了純合突變株系，其含有缺失63bp的FAD2-1A基因、缺失23bp的FAD2-1B基因，前者導緻FAD2-1A蛋白缺失21個氨基酸緻使蛋白失活，後者導緻387個氨基酸的FAD2-1B蛋白變成147個氨基酸的截短蛋白。将包含所需突變的T1代植株繼續種植，收獲T2代大豆，鑒定出了12個缺乏TALEN T-DNA的株系，這些株系将用于繁殖後代。對這12個株系進行全基因組測序來确認大豆基因組中确實不存在TALEN T-DNA，也不存在脫靶的情況。

2017年，Calyxt公司在納斯達克上市，目前有三種盈利策略：将TALEN技術授權給其他公司，可自行開發特定性狀；将公司開發的特定性狀或産品授權給下遊合作夥伴，收取特許權使用費；将種子賣給農業加工商或供應鍊中的其他人。

圖6 Calyxt公司的培養間。為什麼這家公司要用第二代基因編輯技術TALEN呢？因為該公司的聯合創始人、明尼蘇達大學教授Dan Voytas是TALEN工具的發明人。該公司其他的明星産品有高油酸/低亞麻酸大豆、高纖維小麥、優質苜蓿、不褐變馬鈴薯、耐寒燕麥等。圖片來源：World-grain。

紫色番茄

接下來，伯小遠想講一講最近特别火的紫色番茄，和本題目沒太大關系，但是紫色番茄看起來讓人垂涎欲滴，必須得寫一下！伯小遠在查資料的時候發現許多報道誤把它稱為基因編輯産品，在這裡要特别提一下，這個是轉基因産品喔，與基因編輯無關哈。

2022年9月9日，一種經過基因改造的紫色番茄，經美國農業部批準，從2023年開始能夠在美國銷售。紫色番茄是英國公司Norfolk Plant Sciences（NPS）的産品。

圖7 富含高水平花青素的紫色番茄（Big Purple Tomato）。圖片來源：NORFOLK官網。

2008年，該公司的創始人之一Cathie Martin在Nature Biotchnology期刊上發表文章“Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors”，通過在番茄中表達來自金魚草的兩個基因Del和Ros1，産生了一種具有濃郁紫色果肉的獨特番茄。其存儲時間是普通番茄的兩倍，而且，經過測試，喂食這種紫色番茄的老鼠比吃普通番茄的老鼠壽命長30%。

為何誕生了這麼久的紫色番茄才剛剛被批準呢？這是因為2019年美國開始簡化基因工程植物的監管程序，将低風險産品排除在現有規則之外。

圖8 果實特異性啟動子E8分别驅動Del和Ros1基因，轉化番茄品種MicroTom，得到T1代株系 (Butelli et al., 2021)。（a）用于轉化的雙元載體；（b）野生型（上）、Del/Ros1C（中）、Del/Ros1N（下）果實在不同成熟階段的表型；（c）Del/Ros1N番茄植株表型；（d）成熟的野生型番茄果實和Del/Ros1N番茄果實的整體和橫切面。備注1：Del基因編碼一個bHLH型轉錄因子，Ros1基因編碼一個MYB型轉錄因子，均與花青素合成有關。備注2：作者團隊得到了四個株系，分别命名為Del/Ros1 C、N、Y、Z，其中Del/Ros1Z中度積累花青素，Del/Ros1C、Del/Ros1Y強烈積累花青素，而Del/Ros1N異常強烈地積累花青素。

列舉一些其他獲得USDA批準的不受監管的産品：

高纖維小麥：由Calyxt公司使用TALENs技術開發，2018年獲批；

可生産高含量Omega-3的荠藍：由Yield10 Bioscience使用CRISPR技術開發，2017年獲批；

耐旱耐鹽大豆：由明尼蘇達大學使用CRISPR技術開發，2017年獲批；

優質紫花苜蓿：由Calyxt公司使用TALENs技術開發，2017年獲批；

抗黴小麥：由Calyxt公司使用TALENs技術開發，2016年獲批；

不褐變馬鈴薯：由Calyxt公司使用TALENs技術開發，2016年獲批；

糯玉米：由杜邦公司使用CRISPR技術開發，2016年獲批；

不褐變蘑菇：由賓夕法尼亞州立大學使用CRISPR技術開發，2016年獲批。

性狀訂制流程

性狀訂制可分為六個步驟：（1）整體實驗方案設計；（2）構建基因編輯載體；（3）使用原生質體驗證載體的特異性、脫靶率（可選步驟）；（4）将基因編輯載體遞送至植物細胞；（5）通過組織培養将經基因編輯後的細胞再生為植株；（6）對得到的編輯植株進行篩選和分型；（7）對編輯植株進行其他檢測、評估等。

圖9 一種基于基因編輯技術開發糧食作物的方案 (Ishii et al., 2016)。首先設計sgRNAs，在原生質體中驗證其特異性及脫靶性（可選），再将其遞送至植物細胞後分化出編輯苗，對編輯苗的靶位點進行擴增、測序以确定其編輯形式，後續再進行其他表型檢測、安全評估等。

小遠叨叨

我國基因編輯育種基礎研究積累領先世界，這主要體現在基因編輯技術的發文量以及專利發明量上。任何重大技術的突破都意味着原有固化的格局終将會被打破，所以我們國家有望通過基因編輯技術實現育種的彎道超車。這其實可以類比我國的汽車行業，在燃油車時代落後，但在新能源車時代卻處于世界領先地位。國内的科學界也對基因編輯産品持樂觀态度，對于将實驗成果轉化為改善人類健康和生活質量的産品有着極大的熱情，但仍需耐心等待...望有志之士能和我們一起投入到這個工作中，歡迎大家和我們交流、合作、并一起進步！

References：

Ahmad S, Tang L, Shahzad R, et al. CRISPR-Based crop Improvements: A Way Forward to Achieve Zero Hunger. J Agric Food Chem. 2021;69(30):8307-8323. doi:10.1021/acs.jafc.1c02653

Butelli E, Titta L, Giorgio M, et al. Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors. Nat Biotechnol. 2008;26(11):1301-1308. doi:10.1038/nbt.1506

Dong H, Huang Y, Wang K. The Development of Herbicide Resistance Crop Plants Using CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Genes (Basel). 2021;12(6):912. Published 2021 Jun 12. doi:10.3390/genes12060912

Gao C. Genome engineering for crop improvement and future agriculture. Cell. 2021;184(6):1621-1635. doi:10.1016/j.cell.2021.01.005

Gu X, Liu L, Zhang H. Transgene-free Genome Editing in Plants. Front Genome Ed. 2021;3:805317. Published 2021 Dec 2. doi:10.3389/fgeed.2021.805317

Hussain A, Ding X, Alariqi M, et al. Herbicide Resistance: Another Hot Agronomic Trait for Plant Genome Editing. Plants (Basel). 2021;10(4):621. Published 2021 Mar 24. doi:10.3390/plants10040621

Ishii T, Araki M. Consumer acceptance of food crops developed by genome editing. Plant Cell Rep. 2016;35(7):1507-1518. doi:10.1007/s00299-016-1974-2

Shah DM, Horsch RB, Klee HJ, et al. Engineering herbicide tolerance in transgenic plants. Science. 1986;233(4762):478-481. doi:10.1126/science.233.4762.478

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