陽離子交換層析（CEX）在單克隆抗體純化過程中作為重要的純化工具,但是它的實用因蛋白本身化學特性的不同而産生意外的純化效果。例如，蛋白質跟樹脂之間的相互作用引起IgG1構型的改變，因而引起在CEX中出現雙峰的現象。雙峰的出現不僅影響蛋白質收率的下降及會引起下遊工藝開發時間的增加，人力和時間的浪費。因此，在下遊工藝純化過程中要求有效的解決雙峰。

CEX中引起雙峰出現原因有好幾種，比如有些mAb因外表電荷的高濃度的修飾引起的強和弱的結合而出現的雙峰現象，這主要跟mAb中的組氨酸有關系。組氨酸是在20種氨基酸當中在蛋白質裡出現最頻繁的氨基酸，它的帶電荷或者中性受到溶液的pH範圍。組氨酸殘基在疏水性條件下會有酸性pKa及表現慢性質子化現象。因此，mAb在CEX中雙峰的出現跟組氨酸在重鍊中出現位置及它的不同程度的質子化性質有關系（圖1）。

圖1 雙峰現象跟蛋白外表組氨酸殘基之間的相關性(A)

mAb中的組氨酸殘基分布解釋圖和CEX中雙峰現象（B）

圖2高純度的mAb在POROS HS50（強CEX）層析柱線性鹽梯度洗脫過程中出現雙峰（A），兩個峰不僅都含有高純度的mAb還将兩種峰重新進入柱子分别純化時出現同樣洗脫峰（B）。且在不同上樣載量情況下出現同樣的洗脫峰現象（C），說明上樣載量不會引起雙峰且第一個和第二個峰沒有顯著生物學差異。

圖2 mAb在 POROS HS50中鹽梯度洗脫時雙峰現象

除了組氨酸殘基之外洗脫液和洗滌液中的鹽濃度液也會影響雙峰現象，圖2，3 mAb在 POROS HS50柱子上結合後用含 0.1MNaCl的Wash 2 沖洗 (第一個峰對應的鹽濃度)時洗脫下來了有些蛋白，沖洗液鹽濃度降到80mM時沒有洗脫下來蛋白而且洗脫後的峰跟對照比較第一峰小，第二峰變得大了（圖3A）；在洗脫條件不變的情況下，通過改變上樣條件加0.10 NaCl時第一個洗脫峰比沒有加0.1MNaCl明顯變小且跟0.1M ArgHCl處理結果一樣的（圖3B）。表明mAb通過強和弱等兩種結合模式跟柱子結合，80mM NaCl能将第一個峰洗脫下來，但是洗脫下來的蛋白通過強結合方式跟柱子重新結合。上樣溶液裡加的0.10 NaCl幫助mAb強結合模式跟柱子結合減少弱結合。

圖3 mAb在CEX中不同條件處理下的洗脫峰

圖4 mAb在 POROS HS50柱子上結合後用不同pH(4.3-6.5)洗脫液洗脫後都出現寬度不一樣的雙峰，但是在高pH條件下出現大前鋒而小後峰。pH4.6時後峰占優勢; pH5.0時後峰依然占優勢但是前鋒變大；pH5.2時出現大小一樣的兩個峰；pH5.4和pH5.8時前鋒占優勢。這趨勢明顯的顯示前後峰的比例受到洗脫液pH的影響。在mAb中的帶電荷基團中，組氨酸殘基是在pKa值pH6.0時變電荷受體,它pKa值範圍pH(4.5-7.5),在質子化的環境中帶正電荷，在非質子化條件下是中性的。差 1電荷的蛋白亞型就像天然mAb和脫酰胺基的mAb在CEX中出現多峰現象，表明組氨酸殘基跟雙峰的産生有關的（圖4）。

圖4 不同pH洗脫條件對雙峰産生的影響

除了洗脫鹽濃度，pH和上樣條件之外CEX填料的篩選也會影響雙峰的出現，圖5中可以看出POROS HS50, Fractogel SO3-(M),Eshmuno CPX 和monolithic CIM multus SO3- columns CEX層析柱中出現雙峰；Nuvia S, Source 30S,和Sepharose SP FF 層析柱中出現駝峰; 隻在Toyopearl SP 650M 層析柱中出現單峰，因此選合适的層析填料也是解決雙峰的最快的方案之一。

圖5 不同層析填料對雙峰産生的影響

總結，單克隆抗體在CEX純化過程中出現的雙峰因它在柱子内的結合方式的不同而導緻的，組氨酸殘基帶電荷狀态的不一樣而導緻的這種結合方式（強和弱結合）受到pH,溫度，洗脫鹽濃度，柱内保留時間等因素的影響。以上幾個實驗結果可以看出，選擇合适的洗脫pH,洗脫鹽濃度及合适的填料解決雙峰過程中起着很重要的作用，洗脫pH控制在4.6時可有效地降低前鋒面積；洗脫pH不變條件下将洗脫鹽濃度降到80mm時,可有效地消除雙峰現象；洗脫pH,鹽濃度不變的條件下可以考慮換CEX填料進行優化。根據自己項目實際情況選合适的解決方案。

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