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本課題拟采用ANIT誘導IC模型，探讨甘草水煎液對IC模型小鼠肝損傷的防治作用及其機制，為臨床使用甘草水煎液治療IC提供依據。

甘草水煎液對α-萘異硫氰酸酯誘導的肝内膽汁淤積性損傷的防治及其機理研究

沈淑嬌，張志榮，張林林，樊玉娟，譚波，李玥，蔣健，裘福榮

上海中醫藥大學附屬曙光醫院，臨床藥代動力學實驗室，上海201203

【摘要】目的：探讨甘草水煎液對α-萘異硫氰酸酯( ANIT)所緻肝内膽汁淤積症(IC)模型小鼠肝損傷的防治作用。方法：雌性C57BL/6小鼠随機分為正常組、模型組、甘草低劑量組(1. 13 g·kg^-1·d^-1)、甘草中劑量組(2.25 g·kg^-1·d^-1)及甘草高劑量組(4. 50 g·kg^-1·d^-1)，連續給藥10 d，檢測總膽紅素( TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶( AST)及堿性磷酸酶(ALP)水平，HE染色觀察肝髒病理，用LC-MS/MS測定血漿膽汁酸含量，RT-PCR檢測孕烷受體、細胞色素P450 3A11、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1和膽酸鹽外排泵。結果：與模型組相比，甘草低、中劑量組ALT、AST和ALP有下降趨勢；甘草高劑量組ALT、AST和ALP水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，血漿CA濃度在甘草低、中、高劑量分别減少32. 2%、55. 1%和84.4%；血漿CDCA濃度在高劑量減少45. 8%；血漿DCA濃度在甘草低、中、高劑量分别減少49. 1%、52. 5%和67. 1%；血漿LCA濃度在甘草低、中、高劑量分别減少59. 5%、59. 5%和56. 7%。甘草水煎液可增加孕烷受體、細胞色素P450 3A11、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1和膽酸鹽外排泵的mRNA轉錄(P<0.05)，并呈劑量依賴性。結論：甘草水煎液可促進膽汁酸代謝和排泌，減輕膽汁酸負荷，對IC肝損傷起防治作用。

【關鍵詞】甘草水煎液；肝内膽汁淤積症；孕烷受體；防治機制

肝内膽汁淤積症（intrahepatic cholestasis，IC）是由肝細胞及毛細膽管膽汁細胞損害，膽汁酸轉運障礙，膽汁流動異常等相關機制^{[1][24][5-7][8-9]}

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

甘草購于上海康橋中藥飲片有限公司，批号：131231，經徐德生教授确定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的幹燥根；ANIT，批号：101458025，購于美國Sigma-Aldrich公司；肝素鈉注射液（國藥準字：H31022051，2mL: 12 500單位）購于上海第一生化藥業有限公司；其他化學試劑（如甲醛、磷酸二氫鈉、十二水磷酸氫二鈉等）均為國産分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用植物油為初榨橄榄油，實驗用水為去離子水。

1.2 儀器

4000 Q-Trap LC-MS/MS系統（美國ABI/SCIEX公司），LC-20AD液相色譜（日本SHIMADZU公司），IKA-werkeTyp VX2E震蕩器（德國IKA公司），Allegra 64R型低溫高速離心機（美國Beckman公司），AB135-S型分析天平（瑞士METTLER公司），Direct-Q3純水系統（美國Millipore公司）。

1.3 動物

C57BL/6小鼠，雌性，SPF級，6周齡，40隻，體質量20~22g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證号：SCXK(滬)2013 -0016，在上海中醫藥大學實驗動物中心的普通環境中飼養，并适應性飼養2周。

1.4 甘草水煎液的制備

甘草按《中國藥典》2010年版一部規定的臨床劑量并結合相關文獻按體表面積換算成小鼠劑量，分為低、中、高3組，分别對應正常成人7.5、15、30 g/d的用量。稱重後加入10倍量去離子水，浸泡60 min，加熱回流2次，每次1 h，濾過後合并提取液，離心取上清并減壓旋轉蒸發，分别濃縮至按生藥量計為0. 056、0. 113、0.225 g/mL，置于4℃冰箱，待用。制得的甘草水煎液以主要成分甘草酸進行了液相色譜定量，低、中、高劑量組甘草水煎液中甘草酸含量分别為0. 46、0.92、1.84 mg/mL。

1.5 造模藥物的制備

精密稱取ANIT 200 mg，溶于20 mL植物油中，充分混勻溶解制成濃度為10 mg/mL的油溶液，置于4℃冰箱，待用。

1.6 實驗動物給藥方案

适應性喂養1周後，将40隻C57BL/6小鼠随機分為5組，分别為正常組(N)、模型組(M)、甘草低劑量組(GC-L，1.13 g·kg^-1·d^-1)、甘草中劑量組(GC-M，2.25g·kg^-1·d^-1)及甘草高劑量組( GC-H，4.50 g·kg^-1·d^-1)。給藥階段，每天稱重并計算給藥體積(0.4 mL/20g)，每天1次，共10 d。其中甘草低劑量組、甘草中劑量組及甘草高劑量組藥液水浴溫熱後灌胃給藥，正常組及模型組則給予同體積生理鹽水。除正常組外，其餘各組于第7天、第10天在給藥1h後再次給予ANIT油溶液(100 mg/kg，按0.2 mL/20 g)造模，正常組則給予等體積的空白油溶液。末次給藥後，禁食不禁水，12 h後進行取材。

摘眼球取血，分裝肝素抗凝管和不抗凝管，10 000 r/min離心10 min分離血漿和血清，置于- 80℃保存備用。分離肝髒，肝髒經生理鹽水漂洗後，部分肝左葉切片包埋，于10%中性福爾馬林溶液中固定備用，其餘肝組織裝入EP管于-80℃保存備用。

1.7 小鼠血清生化學檢測

小鼠血清樣本于37℃解凍，分别取适量體積送至上海曙光醫院檢驗科進行總膽紅素( TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶( AST)及堿性磷酸酶(ALP)的檢測。

1.8 肝髒病理形态學觀察

肝髒病理切片制備及HE染色均由上海中醫藥大學組織病理實驗室完成。

1.9 血漿膽汁酸檢測

将小鼠血漿樣品于37℃解凍，振蕩混勻，取25 μL于1.5 mL離心管中，加入含内标D5 -LCA的乙腈溶液(30 ng/mL) 100μL，渦旋3 min混勻，10 000 r/min離心10 min，吸取80 μL上清至進樣瓶中供LC-MS/MS分析^[10]。檢測血漿CA、GDCA、CDCA、DCA、LCA、TCA、TCDCA、TDCA、GCA、GCDCA等膽汁酸。

空白血漿處理：小鼠血漿加入适量活性炭(100 mg/mL)^[11-12]後，振搖1h以吸附内源性膽汁酸，10 000 r/min離心10 min去除活性炭備用。

1.10 RT-PCR檢測

按如下操作執行：(1)RNA抽提和反轉錄：利用TAKARA RNAiso提取總RNA。反轉錄反應體系：PrimeScriptTM buffer 2μL, PrimeScriptTM RT Enzyme Mix lμL, Random 6 mers 2μL,Total RNA 500 ng, RNase Free dH₂O 10μL。反轉錄條件：将10 μL反應體系放入PCR儀中，37℃1h，然後85℃5 s，得到的産物為cD-NA，-20℃保存。(2)引物設計和合成：SYBR和Taqman兩種不同的引物。SYBR引物序列：PXR（NM_-010936.3，正向引物序列CCTACATGT-TCAAGGGCGTC反向引物序列TGCACATCT-CAAAAGTGGCC)，CYP3A11（NM_-007818.3，正向引物序列AGCTCTCTCACTGGAAACCT反向引物序列 AGGTTTGGGCCCAGGAATT），BSEP（NM_-021022.3，正向引物序列CTCAGCTGCATGACT-TCGTC反向引物序列AGGATCTCGTACAATGGC-CC)，Gapdh（NM_-008084.2，正向引物序列AG-GTCGGTGTGAACGGATTTG反向引物序列TG-TAGACCATGTAGTTGAGGTCA);Taqman引物：UGT1A1 （Mm02603337_-ml） 和Gapdh（Mm99999915_-）購買于lifetech。反應體系：2×SYBRTM buffer 10 μL，上遊引物（10 μmol/L）0.6 μL，下遊引物（10 μmol/L）0.6 μL，cDNA 2μL，ddH₂O 6.8μL。反應程序：50℃2min，5℃10 min，95℃15 s，60℃30 s 40個循環，95℃15s，60℃60 s，95℃15 s。上機分析（3管重複），以2^-△△Ct表示目的基因mRNA相對表達量，△△Ct=（Ct_目的基因- Ct_GAPDH）_實驗組-(Ct_目的基因-Ct_GAPDH)_對照組。

1.11 數據處理

所有實驗數據均用均數±标準差（±s）表示，采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，使用方差分析( ANOVA)比較5組間是否存在差異，再用Dunnett-t檢驗比較模型組與正常組、甘草低劑量組、甘草中劑量組及甘草高劑量組之間的差異，檢驗水準α=0. 05。

2 結果

2.1 各組小鼠的一般情況

正常組小鼠狀态良好，毛色正常，尿液澄清微黃，體質量穩定增加。模型組小鼠在第一次造模後出現頭頂和背部掉毛；體質量減輕，行動遲緩，尿黃。3組給藥組小鼠造模後體質量也減輕，行動遲緩，未出現掉毛現象。小鼠處死後打開腹腔，其中模型組小鼠腹腔内明顯變黃，肝髒色澤泛白，有膽栓壞死顆粒，膽囊明顯擴大；甘草治療組膽栓壞死顆粒明顯減少，肝髒柔韌無泛白，膽囊大小正常。

2.2 各組小鼠的肝髒病理

正常組、模型組和治療組肝髒病理見圖1。正常組肝小葉結構正常，肝細胞呈索狀排列，整齊有序，無壞死及變性，肝窦無擴張，毛細膽管無淤膽，彙管區未見炎性細胞浸潤，膽管結構正常；模型組肝細胞混濁腫脹出現大量空泡壞死，可見漿液壞死竈，彙管區有炎性細胞浸潤；甘草治療小鼠肝細胞的壞死程度有所改善，甘草低劑量組可見漿液壞死竈，未見細胞空泡壞死。中、甘草高劑量組未見明顯壞死竈，肝細胞形态排列均正常，彙管區有炎性細胞浸潤。

2.3 各組小鼠的肝功能

正常組、模型組、甘草水煎液治療組的TBIL、ALT、AST、ALP水平見表1。與正常組相比，模型組、甘草水煎液治療組血漿TBIL含量明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中、高劑量組TBIL含量差異皆無統計學意義(P>0.05)。

與正常組相比，模型組、甘草低、中、高劑量組小鼠血漿ALT水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中劑量組ALT有下降趨勢，甘草高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組相比，模型組、甘草治療組小鼠血漿AST水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中劑量組AST有下降趨勢，甘草高劑量組AST水平下降有統計學意義(P<0.05)。

與正常組相比，模型組、甘草治療組小鼠血漿ALP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，甘草低、中劑量組ALP有下降趨勢，甘草高劑量組可明顯降低ALP水平(P<0.05)。

2.4 各組小鼠的血漿膽汁酸濃度

血漿膽汁酸的檢測結果見圖2。小鼠血漿膽汁酸主要以牛磺酸結合型(T-)及遊離型為主，甘氨酸結合型(G-)膽汁酸除GCA外均檢測不到。模型組CA、GCA、TCA、TCDCA和TDCA較正常組分别提高4.2倍、63.2倍、870.1倍、502.3倍、4.2倍，而模型組次級膽汁酸DCA、LCA較正常組有所下降，但差異無統計學意義，提示模型組體内膽汁酸明顯淤積。與模型組比較，CA在甘草低、中、高劑量分别減少32. 2%、55. 1%和84. 4%；CDCA在甘草低、中劑量組無明顯減少，而高劑量減少45. 8%；DCA在甘草低、中、高劑量分别減少49. 1%、52. 5%和67. 1%；LCA在甘草低、中、高劑量分别減少59. 5%、59.5%和56. 7%。與模型組比較，結合膽汁酸(GCA、TCA、TCDCA和TDCA)在甘草低、中、高劑量組減少無統計學差異(P>0.05)。

2.5 甘草水煎液對相關基因mRNA轉錄的影響

PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP mRNA轉錄結果見圖3。從圖中可以看出：與正常組相比，模型組的PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP mRNA轉錄升高。與模型組相比，甘草水煎液對PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP mRNA的轉錄升高有顯著意義(P<0.05)。

3 結論

ANIT是經典的造模藥物，在體内經P450代謝後與谷胱甘肽結合，可引起嚴重的膽管上皮細胞壞死，伴有膽管周圍嗜中性粒細胞浸潤，引起肝内膽管增生，從而造成膽管阻塞，引起肝内膽汁淤積^[14]，現已廣泛用于肝内膽汁淤積的研究^[15-16]。

本研究發現，模型組小鼠膽囊明顯擴張，胃腸道呈灰白色，肝髒病理提示膽管上皮細胞水腫、細胞間隙增大，伴有炎性細胞浸潤，膽管管腔變窄，肝細胞明顯空泡壞死。與正常組相比，模型組小鼠的肝功能指标ALT、AST、ALP和TBIL水平明顯升高(P<0.05)，模型組CA、GCA、TCA、TCDCA和TDCA較正常組分别提高4.2倍、63.2倍、870.1倍、502.3倍、4.2倍，提示模型組體内膽汁酸明顯淤積，提示肝内膽管淤積模型制造成功。模型組次級膽汁酸DCA、LCA較正常組有所下降。因為DCA、LCA在小腸中由CA和CD-CA經腸道細菌的7α去羟基酶催化生成而來。模型組膽管阻塞，CA和CDCA排泌至小腸中減少，則DCA、LCA産生減少。與模型組相比，甘草低劑量組、中劑量組對肝功能( ALT、AST、ALP)有改善趨勢，甘草高劑量組對肝功能改善作用明顯：ALT、AST、ALP水平明顯降低(P<0.05)，肝髒病理提示肝細胞壞死明顯改善。甘草水煎液對膽汁淤積小鼠肝損傷具有一定的保護作用，随着劑量增加肝損傷保護作用明顯增強。

肝細胞的膽汁酸主要由CYP450酶羟基化後增強親水性。CYP3A是主要介導膽汁酸羟基化酶，主要受PXR調控。膽汁酸在正常生理狀态多與牛磺酸或甘氨酸結合後經膽管排出。膽汁淤積時則更偏向于與葡萄糖醛酸基團結合，通過外排轉運蛋白排出肝細胞。尿苷葡萄糖醛酸轉移酶類UGTs在膽汁淤積時表達增加，促進膽汁酸代謝；淤積的膽汁酸可通過肝細胞膽管側的BSEP泵入膽管。UGTs和BSEP還受PXR核受體部分調控^[17]。

結果提示甘草水煎液誘導小鼠PXR、CYP3A11、UGT1A1和BSEP的mRNA轉錄，并有劑量依賴性。CYP3A11、UGT1A1是PXR下遊靶基因，PXR對BSEP誘導也有促進作用。CYP3A11和UGT1A1被誘導後可促進膽汁酸的代謝，BSEP被誘導可促進膽汁酸經膽排洩^[17]。膽汁酸分遊離膽汁酸和結合膽汁酸，遊離膽汁酸包括初級膽汁酸(CA、CDCA)和次級膽汁酸( DCA、LCA)。CA、CDCA、DCA、LCA極性弱，肝毒性較強。與模型組比較，CA在甘草低、中、高劑量分别減少32. 2%、55. 1%和84. 4%；CDCA在高劑量減少45. 8%；DCA在甘草低、中、高劑量分别減少49. 1%、52. 5%和67. 1%；LCA在甘草低、中、高劑量分别減少59. 5%、59.5%和56. 7%。遊離膽汁酸減少，肝毒性也會減輕。推測CA、CDCA、LCA可能被CYP3A11和UGT1A1代謝和BSEP排泌。與模型組比較，結合膽汁酸(GCA、TCA、TCDCA和TDCA)在治療組改變不大，這些結合膽汁酸水溶性增大，肝毒性相對較小。

本研究提示甘草水煎液可能通過降低膽汁淤積小鼠的肝内膽汁酸負荷，對IC肝損傷起防治作用。

參考文獻【略】

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