PCR實驗中,引物設計占有十分重要的地位。下面我們就來介紹一下SSR引物設計的方法:
步驟
1、将由misa得到的.misa文件的内容複制至Excel表格,并其分為2、3、4、5、6堿基重複和複合重複(多态性位點較多的一般是2、3堿基重複):

其中紅色部分為SSR位點位置2.将各堿基重複的表格按照重複次數從高到低排序,理論上重複次數越多多态性越高。3.在Excel表格中去除SSR位點靠前或者靠後的序列,比如序列c12900SSR位點過于靠前,c58603SSR位點過于靠後均無法設計SSR引物.4.在原始數據中查找初篩後的數據如c20128進行查找相應序列,将序列輸入Primer6設計引物。

5.引物設計時因考慮到擴增片段的長度一般150-350bp,可以在SSR位點的前後200bp設計:

6.挑選分數大于80.0,擴增片段為150-350bp的高分引物,最好設計50對進行挑選,注意設計的引物不可與SSR位點區段重疊(此例子中SSR位點區段為552-581)。此例中挑選的為第五條。

要求:1 引物長度18-22 bp2 擴增産物100-250 bp3 GC含量35%-65%4 堿基重複次數不多于4,尤其是G或C的單堿基重複最好少于35 兩個引物Tm值差異控制在2℃範圍内
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