cdna能不能用于pcr?在做 qPCR 時，你是怎麼計算 cDNA 的加入體積的呢？小編也經常收到來自小哥哥小姐姐同樣的疑問，那 cDNA 投入多少體積、稀釋多少倍，如何去判定投入的量是否準确呢？接下來我們就一起來了解一下吧，我來為大家講解一下關于cdna能不能用于pcr?跟着小編一起來看一看吧!

cdna能不能用于pcr

在做 qPCR 時，你是怎麼計算 cDNA 的加入體積的呢？小編也經常收到來自小哥哥小姐姐同樣的疑問，那 cDNA 投入多少體積、稀釋多少倍，如何去判定投入的量是否準确呢？接下來我們就一起來了解一下吧！

最常見的2種cDNA投入量的做法

No.1 實驗室傳承下來的稀釋倍數

實驗室可能會有一套 SOP，隻要按照師兄師姐告訴我們的 cDNA 稀釋倍數進行稀釋就可以了！

No.2 使用 Nanodrop 測定 cDNA 的濃度

使用 Nanodrop 測定一下 cDNA 的濃度，按照以往的經驗值進行添加 cDNA，或者按照師兄師姐的 SOP 上寫到的濃度進行添加。

那這兩種做法有什麼弊端呢？

首先：不同處理組的 RNA 的表達量是不一樣的，如果師兄師姐的 RNA 表達量比較高，例如稀釋 1000 倍，CT值為 25，而您的 RNA 表達量比較低，cDNA 原液投入 CT 值已達到 30，那如果您還按照 1000 倍進行稀釋cDNA，那 CT 值已然超出 35 Cycles 了，即便出現擴增曲線，那也是無效的值。

備注：在 SYBR qPCR 中，CT 值超出 35，認為 CT 值是無效的。

如果不稀釋，直接用 cDNA 原液做呢？又會面臨高表達基因的 CT 值偏小，可能已超出 qPCR 線性範圍之外，導緻最終定量結果不準确。

其次：使用 Nanodrop 測定 cDNA 濃度是否可行呢？我們先一起了解一下 Nanodrop 測定核酸的原理吧！

Nanodrop 測定核酸的原理

核酸是由核糖、磷酸基以及堿基構成。其中，由于堿基含有芳香環結構，因此具有紫外吸收的特性。核酸吸收波長為 260 nm，根據朗伯比爾定律，已知物質的消光系數，液層的厚度，就能利用其吸光度來計算出物質的濃度。

與此同時，280 nm 處可檢測蛋白質等；230 nm 處可檢測鹽離子、去污劑、苯酚、乙醇、糖類等，所以還能通過計算 A260/A280 和 A260/A230 的比值，估計核酸純度(純 DNA：A260/A280≈1.7-1.9；A260/A230≈2.0-2.2；純RNA：A260/280≈2.0；A260/A230≈2.0-2.2)。

但紫外吸收法對溶液的 pH 和鹽濃度極為敏感：吸光度本身會受到離子強度以及 pH 這兩個因素的影響，所以容易受到雜質的幹擾。未純化的産物 Nanodrop 濃度測定結果會受到 RNA 殘留、蛋白殘留、鹽離子、糖類等物質的影響，導緻測定值虛高。

而我們拿到的 cDNA 其實就是一個未純化的産物，裡面有逆轉錄後殘留下來的 Buffer、逆轉錄酶、引物核酸等，會嚴重幹擾 Nanodrop 對 cDNA 濃度的測定。所以使用 Nanodrop 測定 cDNA 濃度的做法也是不準确的。

可能說到這裡，有的小夥伴會有疑慮，既然 Nanodrop 測定未純化的核酸的濃度會産生虛高的現象，那把 cDNA 純化一下就 OK 啦？純化是可以去除雜質，使 cDNA 的濃度測定趨于準确，但是純化回收的效率并非100 %，定會損失掉一部分核酸，那必然會對後續定量的結果造成影響。

常見的這兩種 cDNA 投入量的做法都不是很準确，那應該如何确定 cDNA 的稀釋梯度呢？

如何準确确定cDNA的稀釋梯度及投入量？

方法一

将 cDNA 做梯度稀釋，把得到的不同梯度 cDNA 同時進行 qPCR，選擇位于 15-33 範圍内的 CT 值對應的 cDNA 稀釋梯度作為最佳稀釋梯度。如下圖所示。（經驗值認為，CT 值在 15-33 範圍内是準确的）

舉個例子：如要擴增某處理組 GAPDH 内參基因，将逆轉得到的 cDNA 進行 10 倍梯度稀釋，得到的 cDNA 濃度梯度分别為：100（原液）、10-1、10-2、10-3、10-4，将 4 個 cDNA 模闆同時上機做 qPCR，得到的 CT 值分别為：12、15.3、18.6、21.9，所以可以選擇 cDNA 的最佳稀釋梯度為 10-2-10-4，後續再擴增該處理組 GAPDH，就可以選擇 10-2、10-3、10-4任何一個梯度。

方法二

若拿到一個之前沒有做過的體系，不知道其拷貝數高低時，可以先選擇 cDNA 原液進行 qPCR 并得到 CT 值。根據公式：2△CT=濃度差，進行調整最佳 cDNA 稀釋梯度。

舉個例子：某處理組 GAPDH 内參基因，cDNA 原液上樣 1 μl，得到的 CT 值為 10。CT值=10，顯然偏小了，要想使該處理組 GAPDH 内參基因的 CT 值為 20，應該如何計算稀釋梯度呢？依據公式「2△CT=濃度差」可知，△CT=20（預期 CT 值）-10（實際 CT 值）=10，那濃度差=210=1024，也就是說在 cDNA 原液的基礎上稀釋 1024 倍即可使該處理組 GAPDH内參基因的 CT 值達到 20。

不同的體系（基因）、同一基因不同的處理組都需要進行最佳 cDNA 稀釋梯度的驗證，保證所有的體系的 CT 值都落在 15-33 範圍内，可以有效避免因 cDNA 稀釋梯度不準确導緻 CT 值過小或者 CT 值過大，甚至無 CT 值的情況。

注意： cDNA 原液的添加體積不能超出 qPCR 反應體系的 1/10，如 20 μl qPCR 反應體系，cDNA 原液最多隻能上 2 μl，超出 1/10 體系，會對 qPCR 反應産生抑制作用

有些小夥伴讀到這裡可能會有疑問了，如果内參基因表達量較高，使用 cDNA 原液 CT 值=11；目的基因表達量較低，使用 cDNA 原液 CT值=32，不管怎麼稀釋，好像都沒有一個可以折中的 cDNA 稀釋梯度，這種情況下該如何稀釋 cDNA 呢？

極端情況下如何把控 cDNA 的稀釋梯度？

最簡單直接的方法就是：目的基因和内參基因分别進行稀釋！目的基因減少稀釋梯度甚至不稀釋，内參基因增加稀釋倍數。

接着上面例子，我們可以稀釋 512 倍 cDNA 原液，以其為模闆擴增内參基因，使 CT 值為 20 左右；繼續使用 cDNA 原液擴增目的基因，保證其 CT 為 32。這樣就解決掉無法同時兼容内參基因與目的基因的 cDNA 稀釋倍數的問題啦！

但這樣做的前提條件是：保證所有組的内參基因為相同的 cDNA 稀釋梯度，所有組的目的基因為相同的 cDNA 稀釋梯度。

為什麼可以這麼稀釋呢？這種方法可行嗎？會影響相對定量計算的結果嗎？

我們先來回顧一下相對定量的計算公式：

該公式是處理組的△CT值-對照組的△CT值，而△CT=目的基因CT值-内參基因CT值。

01相對定量的計算公式

當目的基因對應 cDNA 不稀釋，内參基因對應 cDNA 稀釋 512 倍，那目的基因與内參基因的差值（△CT）會存在一個稀釋梯度不一緻的差值；

02相對定量的計算公式

當處理組的 △CT 值-對照組的 △CT 值時，這個稀釋梯度不一緻的差值就會被減掉；

03相對定量的計算公式

所以即便内參基因與目的基因對應的 cDNA 稀釋梯度不一緻，對計算結果仍然沒有影響，稀釋梯度不一緻的差異最終是會被減掉的。但前提一定要保證我們上述提到的前提條件哦！

磨刀不誤砍柴工，小夥伴們一定要确定好 cDNA 稀釋梯度後再繼續後續的 qPCR，這樣才能事半功倍。

關于 cDNA 如何稀釋的方法，你是否已經掌握了呢？

明确了 cDNA 稀釋梯度的方法确實可以幫助我們獲得更加準确的實驗數據，但是想要做好逆轉錄和定量實驗，選好「武器裝備」才是最為重要的。

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