MTT實驗法測定細胞增殖

1.實驗材料

1.1. 實驗細胞株

癌細胞株用含有10%新生小牛滅活血清RPMI-1640培養基，培養在37℃、飽和濕度、5%CO2的無菌培養箱中，每隔2～3天進行一次細胞傳代。

1.2 藥物與試劑

RPMI-1640 培養基

DMSO 胰蛋白酶粉

1-甲基乙内酰脲 5-氟尿嘧啶

MTT 粉 甘油

碘化丙啶(PI)

新生小牛血清

1.3 儀器設備

超淨工作台（SW-CJ-2FD 型） 超低溫電冰箱 恒溫水浴箱

低溫高速離心機 恒溫震蕩搖動床

-20℃電冰箱 光學顯微鏡 電子天平 Eppendorf 移液槍（10、100、1000ul） 去離子純水儀 流式細胞儀 低溫數控高速離心機 普通離心機

1.4 主要試劑配方

1.4.1 PBS 溶液

磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.24g、氯化鈉(NaCl)8.0g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.44g、氯化鉀(KCl)0.2g，用去離子水(ddH2O)溶解，然後将其定容使總體積為 1.0L。再使用鹽酸将 pH 值調至 7.4，用無菌鹽水瓶分裝好，高壓消毒滅菌，4℃内保存。臨用前要在 37℃水浴加熱。

1.4.2 細胞培養基

稱取 RIPM-1640 培養基粉 10.4g，用 1.0L ddH2O 溶解，再往溶液中加入 2g NaHCO3，再用鹽酸将 PH 值調整至 7.0，采用抽濾法除菌，無菌鹽水瓶分裝，置于 4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入滅活新生小牛血清，使每瓶培養基中滅活新生小牛血清的濃度為 10%。每次臨用前要将含有 10%滅活新生小牛血清的RPMI-1640 培養基置于 37℃水浴箱中加熱。

1.4.3 新生小牛血清

臨用前，将新生小牛血清置于 56℃水浴中滅活 30min，之後用無菌鹽水瓶分裝密封，再置于-20℃冰箱中保存。

1.4.4 胰蛋白酶

在 100ml 的 PBS 溶液中加入胰蛋白酶粉 0.25g，置于 4℃冰箱中過夜，用直徑為 0.22μm 微孔濾膜除菌器除菌後分裝、密封，置于 4℃冰箱中保存。

1.4.5 MTT 溶液(5mg/ml)

往 50ml 無菌 PBS 中加入 250mg MTT 粉，輕輕搖勻，使 MTT 粉充分溶解，予用直徑為 0.22μm 微孔濾膜除菌後分裝、密封，錫箔紙避光，置于 4℃冰箱中臨時保存（≤7 天），置于-20℃冰箱中短期保存（≤1 月）。

1.4.6 4%多聚甲醛

稱取多聚甲醛 4g 溶于 50ml 蒸餾水中，然後加熱至 70℃左右，用玻璃棒攪拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然後往溶液中逐滴加入濃度為 1mol/L 的 Na0H 至溶液澄清，冷卻，蒸餾水定容至 100ml，用鹽酸将 PH 調至 7.2，錫箔紙避光，置于 4℃冰箱中保存。

1.4.7 蘇木精染液

蒸餾水 700ml，甘油 300ml，蘇木精 5g，碘酸鈉 0.5g，冰醋酸 20ml，硫酸鋁鉀 500g。

1.4.8 伊紅染液

蒸餾水 100ml，伊紅 0.5g，氯化鈣 0.5g。

1.4.9 1-甲基乙内酰脲溶液的配制

1-甲基乙内酰脲（M）分子式為 C4H6N2O2，分子量為 114.10，純度>99.0%，吸取适量該藥物，加入少量 PBS 或生理鹽水（PH7.4），配制成 500 mg·L-1的母液。-20℃保存，臨用時稀釋。

1.4.10 5-Fu 溶液的配制

5- 氟尿嘧啶（ 5-Fu ）分子量為 130.08 ，分子式為 C4H3FN2O2，規格為250mg/10ml，pH 值為 8.4～9.2，吸取适量該藥物，加入少量 PBS 或生理鹽水（PH7.4），配置成 100mgL的母液。-20℃保存，臨用時稀釋。

2.實驗方法.

2.1.細胞培養

2.1.1.細胞複蘇

(1)從-80℃冰箱迅速取出凍存人結腸癌 SW480 細胞的凍存管，然後迅速投入37℃水浴箱中，輕輕搖動凍存管，使凍存管内容物迅速融化，取出後用 75%酒精消毒，放入無菌操作台，在操作台中開啟凍存管。用 1000ul 的移液槍吸出溶解的細胞懸液，注入離心管，同時往離心管中加入 10 倍 10%滅活新生小牛血清RPMI-1640 培養基，準備離心。

(2) 室溫下，1000 rpm，離心 5min，用移液槍吸取離心管中上清液、棄去，然後用細胞培養液洗 1～2 次，棄去上清培養液後，加入 1ml 培養液，用吹打管輕輕吹打，使離心管底部的細胞懸于培養基中，形成懸浮液。

(3)用培養液适當稀釋懸浮液後，用移液槍将細胞懸液接種到 100ml 的無菌培養瓶，蓋好瓶蓋，将接種有人結腸癌 SW480 細胞的培養瓶放入飽和濕度、5%CO2、溫度為 37℃培養箱中培養，24h 後更換培養液，放入培養箱中繼續培養，觀察細胞的生長狀況，待細胞生長狀态基本恢複正常後，取對數期細胞進行實驗。

2.1.2.細胞傳代

(1)在普通光學顯微鏡下觀察觀察細胞的生長狀況，當細胞在培養瓶貼壁面生長融合達 70%～80%時，棄去培養液，然後用 PBS 液洗 1～2 遍。

(2) (2)用 0.25%胰酶細胞消化液，于室溫或 37℃下消化鐵壁細胞數分鐘，邊消化邊在顯微鏡下觀察細胞的形态變化，當 70%細胞的胞膜發生皺縮，細胞體積變小、細胞變圓時，往培養瓶中加入 10%滅活新生小牛血清的 RPMI-1640 培養基4～5ml，終止消化。

(3)用彎頭吸管反複吸取瓶内培養液吹打培養瓶的細胞貼壁生長面，吹打時确保培養瓶底部各個部位都要吹打到，動作輕柔，幅度不要太大，使貼壁細胞脫落形成細胞懸液。

(4)按實驗所需細胞濃度接種，分成 2～3 個培養瓶，置于飽和濕度、5%CO2、溫度為 37℃培養箱中繼續培養。

2.1.3.細胞收集

(1) 在室溫或 37℃下，用 0.25%胰酶消化液消化貼壁細胞，制成細胞懸液。

(2)用移液槍将培養瓶中細胞懸液移入 10ml 離心管，常溫下 1000rpm，離心5min，棄去上清液，再加入 5ml PBS 洗滌 2～3 次。

2.1.4.細胞計數

(1) 在室溫或者 37℃下，用胰酶消化液消化貼壁細胞，制成細胞懸液。

(2)取蓋玻片、計數載玻片各一塊，先用 PBS 清洗幹淨，再用 75%酒精反複擦拭計數載玻片和蓋玻片，然後風幹，蓋上蓋玻片，用 10ul 移液槍吸取細胞懸液 5μl 由蓋玻片一側緩慢的滴入計數載玻片中，使載玻片和蓋玻片之間均勻的充滿細胞懸液體。

(3)在用 10×物鏡顯微鏡下，觀察計數載玻片上四角計數格内所含細胞的總數X。計數原則：細胞壓中線時，數上不數下，數左不數右，細胞團塊合計為一個細胞。

(4)将計數所得細胞總數代入公式，得出細胞密度＝X/4×104個/ml（細胞數/毫升原液）。

2.1.5.細胞凍存

(1)選擇對數期生長的細胞凍存，用濃度為 0.25%胰蛋白酶消化液把培養瓶中的貼壁細胞消化下來，把已經消化好的細胞根據細胞傳代的方法收集起來，同時細胞計算，之後将收集的細胞加到離心管，1000rpm，離心 5min，去上清液。

(2)往離心管中加入凍存液，将細胞密度調整為(5～10)×106個/ml。凍存液的配制：甘油、胎牛血清按體積比 1:9 的比例均勻混合。

(3) 将離心管中含有細胞的凍存液分裝到凍存管，每個凍存管加 1～1.5ml含細胞液， 在 4℃冰箱中放置 30 分鐘，轉入-20℃的冰箱中放置 2h 後，再放入-80℃冰箱 24h，最後轉入液氮罐中保存。

2.2 MTT 比色法檢測 1-甲基乙内酰脲、5-Fu 及兩者聯合對 SW480 細胞增值的抑制作用

2.2.1 實驗分組：分為四大組：對照組（等量PBS）、1-甲基乙内酰脲組(M)、5-Fu-、 甲基乙内酰脲與5-氟尿嘧啶聯合組(M＋Fu)。

2.2.2 1-甲基乙内酰脲對 SW480 細胞的增值抑制作用

根據文獻數據和預實驗，将 1-甲基乙内酰脲組設八個濃度組：M0.5mg·L-1、M5mg·L-1、M10mg·L-1、M20mg·L-1、M50mg·L-1、M100mg·L-1、M200mg·L-1、M500mg·L-1。各組分别幹預人結腸癌 SW480 細胞 24、48、72h，MTT 法檢測1-甲基乙内酰脲對 SW480 細胞增殖抑制作用。 以上實驗各組設置 6 個平行孔，實驗重複三次，分析比較各組細胞增殖抑制率有無統計學差異。

2.2.3 檢測 1-甲基乙内酰脲及 5-Fu 分别對 SW480 細胞增殖的抑制作用

根據文獻數據和上述實驗結果，将 1-甲基乙内酰脲和 5-Fu 各設四個濃度組。

1-甲基乙内酰脲為 M 10mg·L-1、M20 mg·L-1、M50mg·L-1、M100mg·L-1四個濃度，5-Fu 為 Fu 10mg·L-1、Fu20mg·L-1、Fu50mg·L-1、Fu100mg·L-1四個濃度。1-甲基乙内酰脲和 5-Fu 各設的四個濃度組藥物濃度相同，有利于兩者效果比較分析。根據文獻數據和上述實驗結果，選擇各組藥物幹預 48 小時後，進行 MTT 法檢測 1-甲基乙内酰脲、5-Fu 對 SW480 細胞增殖抑制作用。 以上實驗分組中各組設置 6 個平行孔，實驗重複三次，分析比較各組細胞增殖抑制率有無統計學差異。

2.2.4 檢測 1-甲基乙内酰脲與 5-Fu 聯合應用對 SW480 細胞增殖的抑制作用

1-甲基乙内酰脲與 5-Fu 聯合用藥設四個組：M10mg·L-1＋Fu10mg·L-1、M 20mg·L-1＋Fu 20mg·L-1、M50mg·L-1＋Fu50mg·L-1、M100mg·L-1＋Fu100mg·L-1。各組分别幹預人結腸癌 SW480 細胞 48h 後，MTT 法檢測各組對 SW480 細胞增殖的抑制作用，并與單獨應用 5-Fu 作用效果進行比較。以上實驗分組中各組設置 6 個平行孔，實驗重複三次，分析比較各組對細胞增殖抑制率的影響，差異有無顯著性。

2.2.5 MTT比色法基本原理

噻唑藍(MTT)比色實驗是實驗研究中用來檢測細胞生長、存活的方法之一。MTT的基本原理為在活細胞線粒體中外源性的MTT能夠被細胞内的琥珀酸脫氫酶還原為一種紫藍色且難溶于水的結晶物甲瓒，甲瓒沉積在細胞胞質中，但是死亡細胞不會出現此現象。當甲瓒遇到二甲基亞砜(MDSO)時，沉積在細胞中的甲瓒會被MDSO溶解。采用酶聯免疫檢測儀在490nm或570nm的波長處測定甲瓒光密度值(OD值)，用來間接反映活細胞的數量。形成MTT結晶物的量與活細胞的數量成正相關。

2.2.6 實驗操作步驟

(1)接種細胞：用 0.25%胰蛋白酶消化液消化貼壁的單層培養細胞，用含 10%新生小牛血清 RPMI-1640 培養液配制成單個細胞懸液，調細胞懸液内細胞的濃度，使細胞懸液濃度為 3×104個/ml，再将細胞懸液接種細胞于 96 孔培養闆中，一次接種 3 個培養闆，每塊培養闆每孔加入上述細胞懸液 180µl，每孔細胞 5200個。

(2) 培養細胞：将接種好的培養闆置入飽和濕度、37℃、5%CO2培養箱中培養 4h，待細胞貼壁後，用移液槍輕輕吸取培養闆中的上清液、棄去。

(3)各組的藥物幹預：

按照實驗方案，各組藥物按方案濃度加入已接種 SW480 細胞的培養闆中。于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中繼續培養。

(4)呈色：分别在培養箱中培養到研究方案确定的時間後，往 96 孔闆每孔中加入 20µl 5 mg·L-1 MTT 溶液，繼續置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養 4 小時，然後終止培養，用移液槍小心吸除每孔内上清培養液，再往每孔加入DMSO 150µl，然後在搖床上震蕩 10min，待甲攢充分溶解後用酶聯免疫檢測儀比色。

(5)比色：在酶聯免疫檢測儀的 570nm 波長處測定 96 孔闆上每個孔的光密度值(OD 值)，往空白孔中加入蒸餾水，用于調零。

(6)計算公式：細胞生長抑制率(IR)=( 1－加藥組平均 OD 值/正常對照組平均OD 值)×100%。

（7）所得全部數據用 SPSS13.0 統計軟件做統計學處理。

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文章來源于：神經科學臨床和基礎

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