一、大腸埃希氏菌簡介

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）又稱大腸杆菌，廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5℃發酵乳糖産酸産氣，IMViC（靛基質、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗結果為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性杆菌。以此作為糞便污染指标來評價食品的衛生狀況，推斷食品中腸道緻病菌污染的可能性。

二、參考标準

《GB 4789.38-2012 食品安全國家标準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數》。

三、檢驗流程

（一）MPN法

1.初發酵試驗

每個樣品，選擇3個适宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36±1℃培養24±2h，觀察小倒管内是否有氣泡産生，24±2h産氣者進行複發酵試驗，如未産氣則繼續培養48±2h。産氣者進行複發酵試驗。如所有LST肉湯管均未産氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結果。

根據标準菌株對月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯進行驗證。大腸菌群、大腸杆菌和發酵乳糖的革蘭氏陰性細菌産生氣體，在小倒管内有氣泡；其它細菌無氣泡。結果如圖2所示：

a:鼠傷寒沙門氏菌 b:大腸埃希氏菌 c:弗氏檸檬酸杆菌 d:陰溝腸杆菌 e:糞腸球菌 f:空白對照 圖2

2.複發酵試驗

用接種環從産氣的LST肉湯管中分别取培養物1環，移種于已提前預溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5±0.2℃水浴箱内。水浴的水面應高于肉湯培養基液面，培養24±2h，檢查小倒管内是否有氣泡産生，如未有産氣則繼續培養至48±2h。記錄在24h和48h内産氣的EC肉湯管數。如所有EC肉湯管均未産氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結果；如有産氣者，則進行EMB平闆分離培養。

根據标準菌株對EC肉湯進行驗證。糞大腸菌群和大腸杆菌産生氣體，在倒立小發酵管中有氣泡。結果如圖3所示：

a:大腸埃希氏菌 b:鼠傷寒沙門氏菌 c:弗氏檸檬酸杆菌 d:陰溝腸杆菌 e:肺炎克雷伯氏菌 f:空白對照 圖3

3.伊紅美藍（EMB）平闆分離培養

輕輕振搖各産氣管，用接種環取培養物分别劃線接種于EMB平闆，36±1℃培養18～24h。觀察平闆上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。

根據标準菌株對EMB培養基進行驗證。典型大腸埃希氏菌菌落特征為具黑色中心有金屬光澤，産氣腸杆菌為粉紅色菌落無光澤，鼠傷寒沙門氏菌為無色菌落。結果如圖4所示：

a:大腸埃希氏菌 b:産氣腸杆菌 c:鼠傷寒沙門氏菌 圖4

4.革蘭氏染色

挑取營養瓊脂培養基上的純培養的單個可疑菌落，進行革蘭氏染色。大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞杆菌，呈紅色杆狀。結果如圖5所示：

圖5 大腸埃希氏菌的革蘭氏染色結果

5.生化鑒定

取培養物進行靛基質試驗、甲基紅試驗、VP試驗和檸檬酸鹽利用試驗，可選取使用大腸杆菌生化鑒定條進行生化鑒定，大腸埃希氏菌的生化反應結果為靛基質陽性、甲基紅陽性、VP陰性、檸檬酸鹽陰性。如圖6所示：

圖6 大腸埃希氏菌生化鑒定條試驗結果

6.結果判定

大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞杆菌，發酵乳糖、産酸、産氣，IMViC生化試驗為＋＋--或-＋--。隻要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據LST肉湯陽性管數查MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌MPN值。

（二）平闆計數法

圖7 大腸埃希氏菌平闆計數法檢驗程序

1.平闆計數

取2～3個适宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種2個無菌平皿， 每皿1mL。同時取1mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。

将10～15 mL 冷至45±0.5℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，将培養基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固後，再加3～4 mL VRBA-MUG覆蓋平闆表層。凝固後翻轉平闆，36±1℃培養18～24 h。

根據标準菌株對VRBA培養基進行驗證，大腸埃希氏菌為紫紅色菌落，有膽鹽沉澱環；在紫外燈照射下有熒光。結果如圖8所示：

a:大腸埃希氏菌 b:弗氏檸檬酸杆菌 c:陰溝腸杆菌 圖8

注意事項：選擇菌落數在10～100CFU之間的平闆，暗室中360～366nm波長紫外燈照射下，計數平闆上發淺藍色熒光的菌落。

2.結果判定

兩個平闆上發熒光菌落數的平均數乘以稀釋倍數，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌數，以CFU/g(mL)表示。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平闆均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告。

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