實時熒光定量pcr原理和步驟?1、樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋手動劇烈振蕩管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鐘4℃下12000rpm離心15分鐘離心後混合液體将分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層RNA全部被分配于水相中水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%③RNA沉澱 将水相上層轉移到一幹淨無RNA酶的離心管中加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鐘後，于4℃下12000rpm 離心10分鐘此時離心前不可見的RNA沉澱将在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉澱混勻後，4℃下7000rpm離心5分鐘 ⑤RNA幹燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-10分鐘 ⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反複吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用，今天小編就來聊一聊關于實時熒光定量pcr原理和步驟?接下來我們就一起去研究一下吧!

實時熒光定量pcr原理和步驟

1、樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心後混合液體将分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉澱 将水相上層轉移到一幹淨無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鐘後，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉澱将在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鐘。 ⑤RNA幹燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-10分鐘。 ⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反複吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2、RNA質量檢測

1）紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液将分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。① 濃度測定A260下讀值為1表示40 µg RNA/ml。樣品RNA濃度(µg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 µg/ml。具體計算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495µl的TE中，測得A260 = 0.21RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl 取5ul用來測量以後，剩餘樣品RNA為35 µl，剩餘RNA總量為：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg②純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值範圍1.8到2.1。2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定①制膠1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS電泳緩沖液濃度 成分 0.4M MOPS，pH 7.00.1M 乙酸鈉0.01M EDTA灌制凝膠闆，預留加樣孔至少可以加入25 µl溶液。膠凝後取下梳子，将凝膠闆放入電泳槽内，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。②準備RNA樣品取3µgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10µg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。③電泳上樣前凝膠須預電泳5min，随後将樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。④紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，将會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

3、樣品cDNA合成①反應體系序号 反應物 劑量1 逆轉錄buffer 2μl2 上遊引物 0.2μl3 下遊引物 0.2μl4 dNTP 0.1μl5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl6 DEPC水 5μl7 RNA模版 2μl8 總體積 10μl輕彈管底将溶液混合，6000rpm短暫離心。②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃幹浴3分鐘，取出後立即冰水浴至管内外溫度一緻，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。③取出後立即95℃幹浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4、梯度稀釋的标準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR ①β-actin陽性模闆的标準梯度制備 陽性模闆的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。②反應體系如下：标準品反應體系序号 反應物 劑量1 SYBR Green 1 染料 10μl2 陽性模闆上遊引物F 0.5μl3 陽性模闆下遊引物R 0.5μl4 dNTP 0.5μl5 Taq酶 1μl6 陽性模闆DNA 5μl7 ddH2O 32.5μl8 總體積 50μl

輕彈管底将溶液混合，6000rpm短暫離心。管家基因反應體系：序号 反應物 劑量1 SYBR Green 1 染料 10μl2 内參照上遊引物F 0.5μl3 内參照下遊引物R 0.5μl4 dNTP 0.5μl5 Taq酶 1μl6 待測樣品cDNA 5μl7 ddH2O 32.5μl8 總體積 50μl

輕彈管底将溶液混合，6000rpm短暫離心。③制備好的陽性标準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然後93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。

5、 制備用于繪制梯度稀釋标準曲線的DNA模闆①針對每一需要測量的基因，選擇一确定表達該基因的cDNA模闆進行PCR反應。反應體系：序号 反應物 劑量1 10× PCR緩沖液 2.5 ul2 MgCl2 溶液 1.5 ul3 上遊引物F 0.5 ul4 下遊引物R 0.5 ul5 dNTP混合液 3 ul6 Taq聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至總體積為 25ul

輕彈管底将溶液混合，6000rpm短暫離心。35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72ºC延伸5分鐘。②PCR産物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR産物是否為單一特異性擴增條帶。③将PCR産物進行10倍梯度稀釋: 将PCR産物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR産物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

6 、待測樣品的待測基因實時定量PCR ①所有cDNA樣品分别配置實時定量 PCR反應體系。體系配置如下：序号 反應物 劑量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上遊引物 1ul3 下遊引物 1ul4 dNTP 1ul5 Taq聚合酶 2ul6 待測樣品cDNA 5ul7 ddH2O 30ul8 總體積 50 ul

輕彈管底将溶液混合，6000rpm短暫離心。②将配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然後按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，最後72℃7分鐘延伸。

7 、實時定量PCR使用引物列表引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模闆的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模闆的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。8 電泳各樣品的目的基因和管家基因分别進行Realtime PCR反應。PCR産物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView™染色，檢測PCR産物是否為單一特異性擴增條帶。

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