在蛋白印迹 WB 實驗的封閉環節,我們經常疑惑該用脫脂牛奶還是牛血清白蛋白(BSA)來封閉,這兩種封閉稀釋液對實驗有什麼影響?
首先,我們需要了解封閉的目的:減少因非特異性結合而産生的背景。其次,我們需要知道 BSA 和牛奶的區别:BSA 僅由一種蛋白組成,即 60 kDa 的牛血清白蛋白;而牛奶則由許多大小不一的蛋白構成。
所以,CST (Cell Signaling Technology) 推薦牛奶封閉最佳,因為牛奶有更大的機會來減少更多的非特異性結合。我們建議您用經 TBST 稀釋的 5% 牛奶,在室溫下搖晃一小時,來封閉CST所有非偶聯一抗,這包括磷酸化特異性和總抗體。
現在,曾有同學問過,“牛奶中的磷酸酶會怎麼樣?” 或許有一些文章反對使用牛奶來檢測磷酸化信号,這一誤區的出現可能是由于實驗者使用了非實驗級奶粉引起的(國内許多奶粉含有磷酸酶等雜質),但在 CST 的所有内部檢測中,科學家們進行了多次蛋白印迹實驗,從未發現任何這樣的問題。CST建議轉膜後迅速在TBS中洗滌膜幾秒,以便移除殘留的轉膜緩沖液,随後使用5%脫脂牛奶(請使用實驗級的#9999)的TBST室溫封閉1h。另外,CST科學家們每天至少要新鮮配制一次牛奶,有時甚至一天配制多次,因為如果牛奶緩沖液放置了一周、兩周甚至更長時間不使用,那麼磷酸酶影響信号的機率将會增加。

上圖是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb) #13038 用來檢測經 PDGF 處理的 3T3 細胞裂解物的結果圖片。左側膜是用牛奶封閉,右側膜用 BSA 封閉。顯然,用 BSA 封閉的膜的背景更高。但用牛奶封閉膜時,磷酸化信号仍然很強且清晰。
封閉後,請仔細查看一抗的說明書,根據推薦的一抗緩沖液來稀釋一抗,一般推薦牛奶或 BSA,但取決于不同抗體。
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