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失活蛋白質能用考馬斯亮藍檢測嗎

生活更新时间:2024-07-21 04:19:34

失活蛋白質能用考馬斯亮藍檢測嗎（考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度）1

實驗原理

考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質中的堿性氨基酸(特别是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基與考馬斯亮藍G-250染料在堿性條件下可以結合的原理，使染料的最大吸收峰位置由465 nm變為595 nm，溶液顔色也由棕黑色變為藍色，這樣通過分光光度法可以定量測定微量蛋白的濃度。這種蛋白質測定法快速、靈敏，是目前靈敏度最高的蛋白質測定方法。

材料與儀器

1.儀器

10 mL試管6個
試管架1個
0.5 mL、1 mL、5 mL移液管分别2個
恒溫水浴箱
分光光度計

2.材料與試劑

待測蛋白質溶液:白菜勻漿液
考馬斯亮藍試劑:考馬斯亮藍G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL。
标準蛋白質溶液:結晶牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白質含量，根據其純度用0.15 mol/L NaCI配制成1 mg/mL蛋白溶液。

操作步驟

(1）白菜勻漿液的制備:稱取5g白菜葉，用水洗淨，吸幹表面水分，剪碎，加入0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液PBS，0℃~4℃下冰浴研磨15～20 min，12000 r/min冷凍離心10 min，上清即為白菜葉的溶性蛋白溶液。

(2）制備标準曲線:按照下表所示條件進行混合搖勻後，在25℃下保溫10 min，靜置5min，以第一管為空白，在波長595 nm下測定其吸光度值，以标準蛋白的濃度對應吸光度值做線性回歸方程。

失活蛋白質能用考馬斯亮藍檢測嗎（考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度）2

(3）樣品中蛋白質的測定:樣品适當稀釋後，另取一幹淨試管，加入稀釋樣品1.0 mL及考馬斯亮藍試劑5.0 mL，混勻，在25℃下保溫10 min後，靜置5 min，于波長595 nm下測定其吸光度值，代入标準曲線中，計算出蛋白質的含量。

注意事項

（1）合理稀釋待測蛋白溶液，使測定值在标準曲線的線性範圍内。

（2）控制好平行之間的标準誤差。分光光度計檢測吸光度時，至少設置兩個平行孔，取平均值。

（3）正确使用分光光度計。

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