本課題通過嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，使學生能夠體驗從複雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今後學習運用這些技術打下基礎。

課題重點：凝膠色譜法的原理和方法。

課題難點：樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。

課題背景通過當今生物科學在蛋白質研究領域的進展，說明提取、分離高純度的蛋白質的重要性和必要性，進而明确地提出課題目的：以血紅蛋白為實驗材料，學習蛋白質提取和分離的一些基本技術。

（一）凝膠色譜法

知識要點：1.凝膠色譜法的用途；2.凝膠色譜法分離蛋白質的原理。

（二）緩沖溶液

知識要點：1.緩沖溶液的組成和作用機理；2.熟悉一般緩沖溶液的配制方法；3．緩沖溶液廣泛應用于生化實驗、微生物的培養、組織切片和細菌染色以及酶的研究等方面。

（三）電泳

知識要點：1.電泳的基本原理；2.不同類型的電泳。

（一）是否完成對血液樣品的處理

觀察你處理的血液樣品離心後是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉澱，也得不到純淨的紅細胞，影響後續血紅蛋白的提取純度。

（二）凝膠色譜柱的裝填是否成功。

由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

（三）血紅蛋白的分離是否成功

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正确的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區帶均勻、狹窄、平整，随着洗脫液緩慢流出；如果紅色區帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。

你能從凝膠色譜的分離原理分析為什麼凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？

答：凝膠實際上是一些微小的多孔球體，小球體内部有許多貫穿的通道。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒内部，隻能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠内的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子後流出，相對分子質量最小的分子最後流出，從而使各種相對分子質量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱内形成無效的空隙，使本該進入凝膠内部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。

（二）練習

1．答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據分子量的大小分離蛋白質的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數是由多糖類化合物構成，小球體内部有許多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經時，各分子在色譜柱内進行兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規則的擴散運動。相對分子質量較大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒内部，隻能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質量較小的蛋白質分子比較容易進入凝膠内的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質量較大的蛋白質先流出，相對分子質量中等的分子後流出，相對分子質量最小的分子最後流出，這種現象又叫分子篩現象。此外，凝膠本身具有三維網狀結構，相對分子質量大的分子通過這種網狀結構上的空隙時阻力大，而相對分子質量小的分子通過時阻力小，因此不同分子量的蛋白質分子可以獲得分離。

2．答：在一定範圍内，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物（緩沖劑）溶解于水中制得，調節緩沖劑的配比就可制得不同pH範圍的緩沖液。

緩沖溶液的作用是維持反應體系的pH不變。在生物體内進行的各種生物化學過程都是在精确的pH下進行的，受到氫離子濃度的嚴格調控。為了在實驗室條件下準确地模拟生物體内的天然環境，就必須保持體外生物化學反應過程有與體内過程完全相同的pH。

3．答：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向着與其所帶電荷相反的電極方向移動。電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子産生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。

4．答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離；然後通過凝膠色譜法将相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最後經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。

5．答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顔色來判斷什麼時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。

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