看完這篇，你就知道轉基因、基因敲除、基因敲入、條件性基因敲除分别應該如何繁育啦~

小編友情提示，以下

請自備茶水~

Let's begin !

重點

轉基因陽性小鼠與野生型小鼠交配

TG ×WT

這裡說的轉基因，并非廣義上的所有的基因修飾，而是特指外源基因随機地整合到小鼠染色體上獲得的随機插入轉基因小鼠。

通過受精卵顯微注射的方式，通常我們會獲得很多個帶有外源基因插入的首建鼠（Founder）。每一個首建鼠，外源基因插入的位置或次數都是不同的。所以每個首建鼠都應該自成一系，也就是我們說的建系。

怎麼做？看圖說話。

每一個 Founder 鼠分别與野生型（WT）小鼠（比如，常用的C57BL/6J）交配，獲得的 F1子代；經過鼠尾基因型鑒定後，F1代中的陽性小鼠保留并再與野生型小鼠交配，獲得 F2子代；F2代陽性小鼠保留再與野生型小鼠交配，獲得 F3子代；以此類推。一個 Founder 鼠産生的子代，稱為一個系。一般以 Founder 鼠的編号命名，比如：3号 Founder 獲得的後代陽性小鼠，稱為 3系。

F1代中可能出現一窩小鼠沒有一隻是陽性的情況。這是由于外源基因的整合可能發生在多細胞期，導緻 Founder 小鼠中并不是所有細胞（包括生殖細胞）都有外源基因的整合，而是呈嵌合狀态。先别急着扔掉這個 Founder 鼠，因為它仍然有可能是個陽性的 Founder，可以再試着多配幾窩。除非你的 Founder 鼠多到用不完... Lucky you！

還有幾點需要引起注意！

-Founder 鼠之間不能相互交配。

-通常轉基因小鼠的基因型鑒定方法隻能判斷有無外源基因的整合（即陽性或陰性），并不能判斷某特定位點的純合或雜合。

-陽性子代小鼠之間也不建議相互交配。

-基因型陽性并不等于表達陽性，所以交配到F2代以上，還需要對每個系中的部分小鼠進行外源基因表達的檢測，篩選到符合實驗要求的轉基因系。

重點

雜合子與雜合子交配，獲得純合子

/- × /-→-/-

對于采用 ES細胞打靶途徑獲得的基因敲除（KO）小鼠，在 Flp 重組酶去除 Neo 抗性基因以後，可以通過 KO 雜合子（ /-）之間相互交配的方式獲得1/4 KO 純合子小鼠（-/-）、1/2 KO 雜合子小鼠（ /-）以及 1/4同窩野生型對照小鼠（WT）。繁育流程如下圖所示：

該路徑同樣也适用于基因敲入（KI）小鼠。

需要指出的是，對于利用 CRISPR/Cas9 介導的 NHEJ 途徑獲得的 KO 小鼠，情況有所不同，方案類似于轉基因小鼠的繁育。由于 NHEJ DNA修複的結果是随機發生的，所以每一隻 KO Founder 小鼠、甚至一隻 Founder 中每個細胞的基因型都可能是不同的。因此，KO Founder 要與野生型小鼠（比如：C57BL/6J）交配，獲得基因型明确的 F1子代 KO 雜合子（ /-）小鼠。随後，才能進行雜合子小鼠的相互交配。

- 不同的 KO Founder 之間不能相互交配。

-不同的 KO Founder 的子代之間也不建議相互交配。

重點

獲得 flox 純合同時 Cre 陽性的小鼠

（f/f；Cre-）×（f/ ；Cre ）→f/f；Cre

Flox 小鼠在去除 Neo 基因以後（CRISPR/Cas9 途徑獲得的 CKO 小鼠省略此步驟），獲得僅含有兩個 loxP 位點的 flox 雜合子小鼠（flox/ ，可縮寫成 f/ ）。flox 雜合子（f/ ）小鼠與組織特異性或誘導型 Cre 陽性（Cre ）小鼠交配，獲得 flox 雜合同時帶有 Cre （f/ ；Cre ）的小鼠，再與flox 雜合子（f/ ）交配，這樣最終可以獲得 1/8的 flox 純合且帶有 Cre 的條件性基因敲除小鼠（f/f；Cre ）。

是不是覺得1/8的比例太低了？那可以用下面的方法，輕輕松松将效率提高一倍。很簡單，在繁育 f/ ；Cre 的同時，繁育 flox 純合子（f/f），再将這兩種小鼠相互交配。這樣，就可以獲得 1/4 的 f/f；Cre 敲除小鼠啦。

BONUS

資深達人才知道的小貼士，

隻告訴認真讀完全文的你哦！

在設計繁育路線、估算繁育規模的時候，有幾個系數會幫助你更順利地獲得足夠數量的實驗組與對照組：

估算公式：

本文來自：上海南方模式生物

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