專題1 傳統發酵技術的應用

☞課題一 果酒和果醋的制作

1、發酵：通過微生物技術的培養來生産大量代謝産物的過程。

2、有氧發酵：醋酸發酵、谷氨酸發酵

無氧發酵：酒精發酵、乳酸發酵

3、酵母菌是兼性厭氧菌型微生物真菌

酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 、分裂生殖、孢子生殖

4、在有氧條件下，酵母菌進行有氧呼吸，大量繁殖。C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O

5、在無氧條件下，酵母菌能進行酒精發酵。C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2

6、20℃左右最适宜酵母菌繁殖，酒精發酵時一般将溫度控制在18℃-25℃

7、在葡萄酒自然發酵的過程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌。

在發酵過程中,随着酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進入發酵液,使葡萄酒呈現深紅色。

在缺氧呈酸性的發酵液中，酵母菌可以生長繁殖，而絕大多數其他微生物都因無法适應這一環境而受到制約。

8、醋酸菌是單細胞細菌(原核生物),代謝類型是異養需氧型,生殖方式為二分裂。

9、當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；當缺少糖源時，醋酸菌将乙醇變為乙醛，再将乙醛變為醋酸。2C2H5OH＋4O2→CH3COOH＋6H2O

10、控制發酵條件的作用：

①醋酸菌對氧氣的含量特别敏感，當進行深層發酵時，即使隻是短時間中斷通入氧氣，也會引起醋酸菌死亡。

②醋酸菌最适生長溫度為30～35℃，控制好發酵溫度，使發酵時間縮短，又減少雜菌污染的機會。

③有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧化。

11、實驗流程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發酵→果酒（→醋酸發酵→果醋）

12、酒精檢驗：果汁發酵後是否有酒精産生，可以用重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應呈現灰綠色。先在試管中加入發酵液2ｍL，再滴入物質的量濃度為3mol/L的H2SO43滴，振蕩混勻，最後滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩試管，觀察顔色。

13、充氣口是在醋酸發酵時連接充氣泵進行充氣用的；排氣口是在酒精發酵時用來排出二氧化碳的；出料口是用來取樣的。

排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身相連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。開口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用該裝置制酒時，應該關閉充氣口；制醋時，應該充氣口連接氣泵，輸入氧氣。

☞課題二 腐乳的制作

1、多種微生物參與了豆腐的發酵，如青黴、酵母、曲黴、毛黴等，其中起主要作用的是毛黴。毛黴是一種絲狀真菌。代謝類型是異養需氧型。生殖方式是孢子生殖。營腐生生活。

2、原理：毛黴等微生物産生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解為甘油和脂肪酸。

3、實驗流程：讓豆腐上長出毛黴→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制

4、釀造腐乳的主要生産工序是将豆腐進行前期發酵和後期發酵。

前期發酵的主要作用：

1、創造條件讓毛黴生長

2、使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

後期發酵主要是酶與微生物協同參與生化反應的過程。通過各種輔料與酶的緩解作用，生成腐乳的香氣。

5、将豆腐切成3cm×3cm×1cm的若幹塊。所用豆腐的含水量為70％左右，水分過多則腐乳不易成形。

水分測定方法如下：精确稱取經研缽研磨成糊狀的樣品5～10g(精确到0.02mg)，置于已知重量的蒸發皿中，均勻攤平後，在100～105℃電熱幹燥箱内幹燥4h，取出後置于幹燥器内冷卻至室溫後稱重，然後再烘30min，直至所稱重量不變為止。

樣品水分含量（%）計算公式如下：

(烘幹前容器和樣品質量—烘幹後容器和樣品質量)/烘幹前樣品質量

毛黴的生長：條件：将豆腐塊平放在籠屜内，将籠屜中的控制在15～18℃，并保持一定的溫度。

來源：1.來自空氣中的毛黴孢子；2. 直接接種優良毛黴菌種

時間：5天

加鹽腌制：将長滿毛黴的豆腐塊分層整齊地擺放在瓶中，同時逐層加鹽，随着層數的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時間約為8天左右。

用鹽腌制時，注意控制鹽的用量：鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長，可能導緻豆腐腐敗變質；鹽的濃度過高會影響腐乳的口味

食鹽的作用：1.抑制微生物的生長，避免腐敗變質；2.析出水分，是豆腐變硬，在後期制作過程中不易酥爛；3.調味作用，給腐乳以必要的鹹味；4.浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。

配制鹵湯：鹵湯直接關系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。

酒的作用：1.防止雜菌污染以防腐；2.與有機酸結合形成酯，賦予腐乳風味；3.酒精含量的高低與腐乳後期發酵時間的長短有很大關系，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。

香辛料的作用：1.調味作用；2.殺菌防腐作用；3.參與并促進發酵過程

防止雜菌污染：①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷幹淨後要用沸水消毒；②裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地擺放好豆腐、加入鹵湯後，要用膠條将瓶口密封。封瓶時，最好将瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。

☞課題三 制作泡菜

制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代謝類型是異養厭氧型。在無氧條件下，降糖分解為乳酸 。分裂方式是二分裂。反應式為：

,含抗生素牛奶不能生産酸奶的原因是抗生素殺死乳酸菌。常見的乳酸菌有乳酸鍊球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生産酸奶。

亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生産中用作食品添加劑。膳食中的亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，國家規定肉制品中不超過30mg/kg，醬腌菜中不超過20mg/kg，嬰兒奶粉中不超過2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收後随尿液排出體外，但在适宜pH 、溫度和一定微生物作用下形成緻癌物質亞硝胺。

一般在腌制 10 天後亞硝酸鹽含量開始降低，故在10天之後食用最好。

測定亞硝酸鹽含量的原理是在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發生重氮化反應後，與 N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結合形成玫瑰紅色染料，與已知濃度的标準顯色液目測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。

專題二 微生物的培養與應用

☞課題一 微生物的實驗室培養

培養基：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養基質，是進行微生物培養的物質基礎。

培養基按照物理性質可分為液體培養基、半固體培養基和固體培養基。在液體培養基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養基中用作凝固劑）後，制成瓊脂固體培養基。

微生物在固體培養基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養基應用于工業或生活生産，固體培養基應用于微生物的分離和鑒定，半固體培養基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。

按照成分培養基可分為人工合成培養基和天然培養基。合成培養基是用成分已知的化學物質配制而成，其中成分的種類比例明确，常用于微生物的分離鑒定。天然培養基是用化學成分不明的天然物質配制而成，常用于實際工業生産。

按照培養基的用途，可将培養基分為選擇培養基和鑒定培養基。選擇培養基是指在培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒别培養基是根據微生物的特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒别不同類别的微生物。

培養基的化學成分包括水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等。

碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質。如CO2、NaHCO3等無機碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養微生物隻能利用有機碳源。單質碳不能作為碳源。

氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質。如N2、NH3、NO3-、NH4 （無機氮源）蛋白質、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有機氮源）等。隻有固氮微生物才能利用N2。

培養基還要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。例如，培養乳酸杆菌時需要在培養基中添加維生素，培養黴菌時須将培養基的pH調至酸性，培養細菌是需要将pH調至中性或微堿性，培養厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件。

獲得純淨培養物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

①對實驗操作的空間、操作者的衣着和手，進行清潔和消毒。

②将用于微生物培養的器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌。

③為避免周圍環境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。

④實驗操作時應避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

消毒與滅菌的區别：

消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或内部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對于一些不耐高溫的液體）還有化學藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。

滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、幹熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

滅菌方法：

①接種環、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；

②玻璃器皿、金屬用具等使用幹熱滅菌法，所用器械是幹熱滅菌箱 ；

③培養基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 ；

④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈 。

比較項

理化因素的作用強度

消滅微生物的數量

芽孢和孢子能否被消滅

消毒

較為溫和

部分生活狀态的微生物

不能

滅菌

強烈

全部微生物

能

制作牛肉膏蛋白胨固體培養基：

（1）方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平闆。

（2）倒平闆操作的步驟：

①将滅過菌的培養皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿錐形瓶，将瓶口迅速通過火焰。

③用左手的拇指和食指将培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手将錐形瓶中的培養基（約10～20mL）倒入培養皿，左手立即蓋上培養皿的皿蓋。

④等待平闆冷卻凝固，大約需5～10min。然後，将平闆倒過來放置，使培養皿蓋在下、皿底在上。

倒平闆操作的讨論

1. 培養基滅菌後，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平闆。你用什麼辦法來估計培養基的溫度？

提示：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平闆了。

2. 為什麼需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。

3. 平闆冷凝後，為什麼要将平闆倒置？

答：平闆冷凝後，皿蓋上會凝結水珠，凝固後的培養基表面的濕度也比較高，将平闆倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。

4. 在倒平闆的過程中，如果不小心将培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平闆還能用來培養微生物嗎？為什麼？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平闆培養微生物。

純化大腸杆菌：

（1）微生物接種的方法最常用的是平闆劃線法和稀釋塗布平闆法。

（2）平闆劃線法是通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作。将聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基的表面。在數次劃線後培養，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。

（3）稀釋塗布平闆法是将菌液進行一系列的梯度稀釋，然後将不同稀釋度的菌液分别塗布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。分為系列稀釋操作和塗布平闆操作兩步。

（4）用平闆劃線法和稀釋塗布平闆法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。

（5）平闆劃線法操作步驟：

①将接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅。

②在火焰旁冷卻接種環，并打開棉塞。

③将試管口通過火焰。

④将已冷卻的接種環伸入菌液中蘸取一環菌液。

⑤将試管通過火焰，并塞上棉塞。

⑥左手将皿蓋打開一條縫隙，右手将沾有菌種的接種環迅速伸入平闆内，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養皿。

⑦灼燒接種環，待其冷卻後，從第 一區域劃線的末端開始往第二區域内劃線。重複以上操作，在三、四、五區域内劃線。注意不要将最 後一區的劃線與第一區相連。

⑧将平闆倒置放入培養箱中培養。

平闆劃線操作的讨論：

1. 為什麼在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什麼？

答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；

每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束後，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。

劃線結束後灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。

2. 在灼燒接種環之後，為什麼要等其冷卻後再進行劃線？

答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。

3. 在作第二次以及其後的劃線操作時，為什麼總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線後，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目随着劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

（6）塗布平闆操作的步驟：

①将塗布器浸在盛有酒精的燒杯中。

②取少量菌液，滴加到培養基表面。

③将沾有少量酒精的塗布器在火焰上引燃，待酒精燃盡後，冷卻8～10s。

④用塗布器将菌液均勻地塗布在培養基表面。

塗布平闆操作的讨論：

塗布平闆的所有操作都應在火焰附近進行。結合平闆劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？

提示：應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合适、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。

菌種的保存：

（1）對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。

①臨時保藏方法

将菌種接種到試管的固體斜面培養基上，在合适的溫度下培養。當菌落長成後，将試管放入4℃的冰箱中保藏。以後每3～6個月，都要重新将菌種從舊的培養基上轉移到新鮮的培養基上。

②缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或産生變異。

（2）對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油後滅菌。将1mL培養的菌液轉移到甘油瓶中，與甘油充分混勻後，放在－20℃的冷凍箱中保存。

課題二 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數

尿素是一種重要的農業氮肥，尿素并不能直接被農作物吸收。隻有當土壤中的細菌将尿素分解成氨之後，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶。尿素最初是從人的尿液中發現的。

篩選菌株：

（1）實驗室中微生物的篩選應用的原理

人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。

（2）選擇性培養基

在微生物學中，将允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基，稱作選擇培養基。

（3）配制選擇培養基的依據

根據選擇培養的菌種的生理代謝特點加入某種物質以達到選擇的目的。例如，培養基中不加入有機物可以選擇培養自養微生物；培養基中不加入氮元素，可以選擇培養能固氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養金黃色葡萄球菌等。

統計菌落數目：

（1）測定微生物數量的常用方法有稀釋塗布平闆法和顯微鏡直接計數。

（2）稀釋塗布平闆法統計樣品中活菌的數目的原理。

當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平闆上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結果準确，一般設置3～5個平闆，選擇菌落數在30～300的平闆進行計數，并取平均值。統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數來表示。

采用此方法的注意事項：

1、一般選取菌落數在30~300之間的平闆進行計數

2、為了防止菌落蔓延，影響計數，可在培養基中加入TTC

3、本法僅限于形成菌落的微生物

設置對照：設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的幹擾，證明确實是所測試的條件引起相應的結果。

實驗設計：實驗設計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。

（1）土壤取樣：同其他生物環境相比，土壤中的微生物，數量最大，種類最多。在富含有機質的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。

（2）樣品的稀釋：樣品的稀釋程度将直接影響平闆上生長的菌落數目。在實際操作中，通常選用一定稀釋範圍的樣品液進行培養，以保證獲得菌落數在30~300之間、适于計數的平闆。

測定土壤中細菌的數量，一般選用104 105 106

測定放線菌的數量，一般選用103 104 105

測定真菌的數量，一般選用102 103 104

（3）微生物的培養與觀察

不同種類的微生物，往往需要不同的培養溫度和培養時間。細菌30~37℃，1~2天；放線菌25~28℃，5~7天；黴菌25~28℃，3~4天

每隔24小時統計一次菌落數目，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導緻一樓菌落的數目。一般來說，在一定的培養條件下（相同的培養基、唯獨及培養時間），同種微生物表現出穩定的菌落特征。

課題三 分解纖維素的微生物的分離

纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質。

纖維素與纖維素酶：

（1）棉花是自然界中纖維素含量最高的天然産物，木材、作物稭稈等也富含纖維素。

（2）纖維素酶是一種複合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶将纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養。

纖維素分解菌的篩選：

（1）篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顔色反應直接對微生物進行篩選。

（2）剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理：

剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色複合物，但并不和水解後的纖維二糖和葡萄糖發生這種反應。當我們在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養基中的纖維素形成紅色複合物。

當纖維素被纖維素酶分解後，剛果紅－纖維素的複合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否産生透明圈來篩選纖維素分解菌。

分離分解纖維素的微生物的實驗流程：

土壤取樣→選擇培養（此步是否需要，應根據樣品中目的菌株數量的多少來确定）→梯度稀釋→将樣品塗布到鑒别纖維素分解菌的培養基上→挑選産生透明圈的菌落

（1）土壤采集 選擇富含纖維素的環境。

（2）剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平闆操作、制備菌懸液、塗布平闆

（3）剛果紅染色法種類

一種是先培養微生物，再加入剛果紅進行顔色反應，另一種是在倒平闆時就加入剛果紅。

課題延伸：

對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選後，隻是分離純化的第一步，為确定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發酵産纖維素酶的實驗，纖維素酶的發酵方法有液體發酵和固體發酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素後所産生的葡萄糖進行定量的測定。

專題三 植物的組織培養技術

☞課題一 菊花的組織培養

植物組織培養的基本過程：

細胞分化：在生物個體發育過程中，細胞在形态、結構和生理功能上出現穩定性差異的過程。

離體的植物組織或細胞，在培養了一段時間以後，會通過細胞分裂，形成愈傷組織，愈傷組織的細胞排列疏松而無規則，是一種高度液泡化的呈無定形狀态的薄壁細胞。

由高度分化的植物組織或細胞産生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化，或者叫做去分化。脫分化産生的愈傷組織繼續進行培養，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫做再分化。再分化形成的試管苗，移栽到地裡，可以發育成完整的植物體。

植物細胞工程：具有某種生物全套遺傳信息的任何一個活細胞，都具有發育成完整個體的能力，即每個生物細胞都具有全能性。但在生物體的生長發育過程中并不表現出來，這是因為在特定的時間和空間條件下，通過基因的選擇性表達，構成不同組織和器官。

植物組織培養技術的應用有：實現優良品種的快速繁殖；培育脫毒作物；制作人工種子；培育作物新品種以及細胞産物的工廠化生産等。

細胞分化是一種持久性的變化，它的生理意義是：使多細胞生物體中細胞結構和功能趨向專門化，有利于提高各種生理功能的效率。

比較根尖分生組織和愈傷組織的異同：

影響植物組織培養的條件：

材料：不同的植物組織，培養的難易程度差别很大。植物材料的選擇直接關系到試驗的成敗。植物的種類、材料的年齡和保存時間的長短等都會影響實驗結果。菊花組織培養一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側枝作材料。

一般來說，容易進行無性繁殖的植物容易進行組織培養。選取生長旺盛嫩枝進行組培的是嫩枝生理狀态好，容易誘導脫分化和再分化。

營養：離體的植物組織和細胞，對營養、環境等條件的要求相對特殊，需要配制适宜的培養基。常用的培養基是MS培養基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有機物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。

激素：植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵性激素。在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現加強趨勢。在培養基中需要添加生長素和細胞分裂素等植物激素，其濃度、使用的先後順序、用量的比例等都影響結果。

使用順序

實驗結果

先生長素，

後細胞分裂素

有利于分裂但不分化

先細胞分裂素，

後生長素

細胞既分裂也分化

同時使用

分化頻率提高

生長素／ 細胞分裂素比值與結果

比值高時

促根分化，

抑芽形成

比值低時

促芽分化，

抑根形成

比值适中

促進愈傷組織生長

環境條件：PH、溫度、光等環境條件。

不同的植物對各種條件的要求往往不同。進行菊花的組織培養，一般将pH控制在5.8左右，溫度控制在18~22℃，并且每日用日光燈照射12h。

操作流程：

配制MS固體培養基：

配制各種母液：将各種成分按配方比例配制成的濃縮液（培養基母液）。

使用時根據母液的濃縮倍數，計算用量，并加蒸餾水稀釋。

配制培養基：應加入的物質有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機物和植物激素的母液，并用蒸餾水定容到1000毫升。

在菊花組織培養中，可以不添加植物激素。

原因是菊花莖段組織培養比較容易。

滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。

MS培養基中各種營養物質的作用是什麼？與肉湯培養基相比，MS培養基有哪些特點？

答：大量元素和微量元素提供植物細胞所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，維持細胞滲透壓；甘氨酸、維生素等物質主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響後所産生的特殊營養需求。

微生物培養基以有機營養為主，MS培養基則需提供大量無機營養。

外植體的消毒：

外植體：用于離體培養的植物器官或組織片段。

選取菊花莖段時，要取生長旺盛的嫩枝。菊花莖段用流水沖洗後可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗後在流水下沖洗20min左右。

用無菌吸水紙吸幹外植體表面的水分，放入體積分數為70%的酒精中搖動2~3次，持續6~7s，立即将外植體取出，在無菌水中清洗。

取出後仍用無菌吸水紙吸幹外植體表面水分，放入質量分數為0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出後，在無菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

注意：對外植體進行表面消毒時，就要考慮藥劑的消毒效果，又要考慮植物的耐受能力。

接種：接種過程中插入外植體時形态學上端朝上，每個錐形瓶接種7～8個外植體。外植體接種與細菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無菌操作。

培養：應該放在無菌箱中進行，并定期進行消毒，保持适宜的溫度（18~22℃）和光照（12h）。

移栽：栽前應先打開培養瓶的封口膜，讓其在培養間生長幾日，然後用流水清洗根部培養基。然後将幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠岩等環境中生活一段時間，進行壯苗。最後進行露天栽培。

栽培：外植體在培養過程中可能會被污染，原因有外植體消毒不徹底；培養基滅菌不徹底；接種中被雜菌污染；錐形瓶密封性差等。

☞專題二 月季的花藥培養

被子植物的花粉發育被子植物的雄蕊通常包含花絲、花藥兩部分。花藥為囊狀結構，内部含有許多花粉。花粉是由花粉母細胞經過減數分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細胞。

被子植物花粉的發育要經曆小孢子四分體時期、單核期和雙核期等階段。在小孢子四分體時期，4個單倍體細胞連在一起，進入單核期時，四分體的4個單倍體細胞彼此分離，形成4個具有單細胞核的花粉粒。

這時的細胞含濃厚的原生質，核位于細胞的中央（單核居中期）。随着細胞不斷長大，細胞核由中央移向細胞一側（單核靠邊期），并分裂成1個生殖細胞核和1個花粉管細胞核，進而形成兩個細胞，一個是生殖細胞，一個是營養細胞。生殖細胞将在分裂一次，形成兩個精子。

注意：

①成熟的花粉粒有兩類，一類是二核花粉粒，其花粉粒中隻含花粉管細胞核和生殖細胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一類是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖細胞就進行一次有絲分裂，形成兩個精子，此花粉粒中含有兩個精子核和一個花粉管核（營養核）

②花粉發育過程中的四分體和動物細胞減數分裂的四分體不同。花粉發育過程中的四分體是花粉母細胞經減數分裂形成的4個連在一起的單倍體細胞；而動物細胞減數分裂過程中的四分體是聯會配對後的一對同源染色體，由于含有四條染色單體而稱為四分體。

③同一生殖細胞形成的兩個精子，其基因組成完全相同。

産生花粉植株的兩種途徑通過花藥培養産生花粉植株（即單倍體植株）一般有兩種途徑，一種是花粉通過胚狀體階段發育為植物，另一種是花粉在誘導培養基上先形成愈傷組織，再将其誘導分化成植株。這兩種途徑之間并沒有絕對的界限，主要取決于培養基中激素的種類及其濃度配比。

注意：

①無論哪種産生方式，都要先誘導生芽，再誘導生根

②胚狀體：植物體細胞組織培養過程中，誘導産生的形态與受精卵發育成的胚非常類似的結構，其發育也與受精卵發育成的胚類似，有胚芽、胚根、胚軸等完整結構，就像一粒種子，又稱為細胞胚。

影響花藥培養的因素誘導花粉能否成功及誘導成功率的高低，受多種因素影響，其中材料的選擇與培養基的組成是主要的影響因素。

親本的生理狀況：花粉早期是的花藥比後期的更容易産生花粉植株，選擇月季的初花期。

合适的花粉發育時期：一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側的時期，花藥培養成功率最高。

花蕾：選擇完全未開放的花蕾。

親本植株的生長條件、材料的低溫預處理以及接種密度等對誘導成功率都有一定影響。

材料的選取：選擇花藥時，一般要通過鏡檢來确定其中的花粉是否處于适宜的發育期。确定花粉發育時期的最常用的方法是醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細胞核不易着色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能将花粉細胞核染成藍黑色

接種和培養：滅菌後的花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立即将花藥接種到培養基上。

在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥（否則接種後容易從受傷部位長生愈傷組織），同時還要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成，通常每瓶接種花藥7～10個,培養溫度控制在25℃左右,不需要光照。

幼小植株形成後才需要光照。

一般經過20～30天培養後,會發現花藥開裂,長出愈傷組織或形成胚狀體。将愈傷組織及時轉移到分化培養基上，以便進一步分化出再生植株。

如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥内就會産生大量幼小植株，必須在花藥開裂後盡快将幼小植株分開，分别移植到新的培養基上，否則這些植株将很難分開。還需要對培養出來的植株做進一步的鑒定和篩選。

植物組織培養技術與花藥培養技術的相同之處是：培養基配制方法、無菌技術及接種操作等基本相同。

兩者的不同之處在于：花藥培養的選材非常重要，需事先摸索時期适宜的花蕾；花藥裂開後釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養基；花藥培養對培養基配方的要求更為嚴格。這些都使花藥培養的難度大為增加。

專題五 DＮＡ和蛋白質技術

☞課題一ＤＮＡ的粗提取與鑒定

提取DNA的溶解性原理包括DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度的特點：在0.14mol/L時溶解度最小；要使DNA溶解，需要較高濃度？要使DNA析出，又需要0.14mol/L的濃度？

在溶解細胞中的DNA時，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特别是95％冷卻酒精），但細胞中蛋白質可溶于酒精。

從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉澱析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。

采用DNA不溶于酒精的原理，可以達到的目的是：将DNA和蛋白質進一步分離。

提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應選用蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶隻水解蛋白質而不會對DNA産生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質變性沉澱，而DNA不會變性。

補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術中DNA變性溫度在95℃。

當鑒定提取出的物質是否是DNA時，需要使用什麼指示劑進行鑒定？

答：在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現藍色。

原理總結：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步将DNA與蛋白質分離開來，達到提純的目的；最後利用二苯胺試劑鑒定提取的物質是否是DNA。

實驗材料的選取：

不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。

本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝髒細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設備要求較高，操作繁瑣，曆時較長。

雞血細胞破碎以後釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。

破碎細胞，獲取含DNA的濾液：

若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？

答：在雞血細胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾後收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾後收集濾液。

為什麼加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？

答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞内，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。

在以上實驗中，加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分别是什麼？

答：過濾時應當選用（濾紙、尼龍布）。血細胞在蒸餾水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細胞膜；食鹽溶解DNA物質；選用尼龍布進行過濾。

在處理植物組織時需要進行研磨，其目的是什麼？研磨不充分産生什麼結果？

答：破碎細胞壁，使核物質容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分會使DNA的提取量減少，影響實驗結果，導緻看不到絲狀沉澱物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。具體做法。10mL雞血＋20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液。

為什麼反複地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？

答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反複溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。

最初獲得的DNA濾液含有蛋白質、脂質等雜質，需要進一步提純DNA。

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；

方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質，不分解DNA；

方案三的原理是蛋白質和DNA的變性溫度不同。

方案二與方案三的原理有什麼不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離。

析出與鑒定：

在濾液中仍然含有一些雜質，怎樣除去這些雜質呢？得到的DNA呈何顔色？

答：濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。

怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？

答：具體做法：試管2支，編号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顔色變化。

實驗操作：

制備雞血細胞液…………加檸檬酸鈉，靜置或離心

↓

破碎細胞，釋放DNA… 加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌

↓→過濾，除去細胞壁、細胞膜等。

溶解核内DNA………… 加入NaCl至2mol/L，同一方向緩慢攪拌

↓

DNA析出……………… 加蒸餾水至0.14mol/L，過濾，在溶解到2mol/L溶液中

↓→除去細胞質中的大部分物質。

DNA初步純化………… 與等體積95％冷卻酒精混合，析出白色絲狀物

↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鑒定……………… 二苯胺，沸水浴，呈現藍色

注意事項：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細胞破裂快速攪拌）；玻棒不要碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現用現配等。

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