抗原和抗體特異性結合的效率是非特異性結合的數百萬--數十億倍，當特異性抗體與非特異性'抗體'競争時，盡管抗體稀釋液中封閉蛋白的濃度是一抗濃度20K：1以上，在碰撞幾率相同的條件下，由于時間的積累加孵育過程中反複漂洗，特異性一抗積累了識别、結合優勢。

同樣在TBST等漂洗的情況下，由于親和力等原因，一抗很牢靠并進一步增加對比優勢，再經過2抗特異性積累和ECL的最終放大形成特異性條帶和非特異性背景之間熒光信号的巨大差異。

由此也可以解釋WB中出現的現象。

1.在樣品制備時， PBS漂洗目的時去除培養基中BSA。不漂洗的後果，是在BSA位置任何抗體都可以非特異性的結合從而顯影。用碰撞的原理去解釋：當雜帶很濃的時候，抗體的特異性已經毫無意義，它隻符合物理定律中的碰撞幾率原理；因為你的雜帶濃，碰撞幾率大，粘附一抗的機會多，因此它就會顯出來，但切記這是雜帶。當雜蛋白含量高到一定程度，“任何”一種一抗都可以在該位置顯出條帶。

2.因此，用條帶的深淺去判斷是否是靶蛋白，這是非常不科學的。在默認抗體有效的情況下，如果抗原靠近區域沒有雜帶，背景幹淨，依據分子量大小可以初步确認靶蛋白的位置；如果有雜帶，并不一定是特異性條帶就比雜帶亮，也許雜帶蛋白濃度大，非特異性粘附的一抗更多。目前判斷雜帶和靶蛋白的唯一标準是分子量；而當分子量大小類似時，隻有通過增加過表達或IP純化的樣品做陽性對照，或者KD該蛋白的樣品做陰性對照一起電泳轉膜，才能準确區分靶蛋白和雜質。（用IP或KD樣品也是驗證商品化抗體是否有效的可靠方案）。

靶蛋白分子量該如何确定？

由1中的解釋可知，雜帶比靶蛋白熒光信号強且幹淨一點也不意外，而經常不同的公司對同一靶蛋白給出不同的分子量，那麼如何确定新上手不熟悉的靶蛋白的分子量呢？

A. 用“過表達或IP純化的樣品做陽性對照”，這是最靠譜的方案。

B. 沒有純化蛋白做對照時，對一個蛋白的分子量判斷一般有這樣幾步：

1).根據氨基酸長度自己預測，如300aa，分子量應為33KDa；以這個分子量為基準進行第二步。

2).去抗體公司網站search說明書。一般先不要有偏向性，很快你至少可以發現3家是一緻或接近的（諸如52KDa，有的寫54KDa，有的51KDa，這些都可以算作一樣，因為表觀分子量也是對應marker的相對估算，會有一點點差異；尤其當不同公司給的marker在靶蛋白區域上下差别很大時，比如，你的蛋白100KDa，有的公司在此區間的marker是180KDa直接jump到80KDa，有的可能中間多一條120KDa，那麼這兩種marker估算的表觀分子量可能差10KDa以上--尤其蛋白較大時，膠濃度又不低，分離會不太好，一些距離的細微差異，在軟件估算表觀分子量時偏差可能很大；其他蛋白這類問題不多，因為通常商品化的marker在120KDa以下指示條帶較為密集，而且一般濃度的膠對這些區段分離都很好，所以估算的表觀分子量差别不大，如上述52KDa例子），那麼最終的表觀分子量基本就是你檢索到的。如果和1中一緻，那麼完全不用懷疑；如果不一緻，有條件再用純化的含标簽的蛋白做驗證，沒有基本也可以follow多數意見--必須指出，很多抗體公司在具體到每一種抗體的說明書時常見虛假廣告的嫌疑，“恁把雜帶當靶蛋白”（最搞的情況是同一公司同一靶蛋白，可能有用不同區段制備的靶蛋白的抗體，而這幾種抗體識别的靶蛋白分子量還很不一緻），所以請follow多數意見。

3). 蛋白一般隻可能因為修飾向上遷移，所以表觀分子量比根據氨基酸長度計算值高常見；反過來，如果表觀分子量比計算值還低，多半就是雜帶；除非你的蛋白會降解，或者有的蛋白在ORF裡面還有一個翻譯起始位點。

經驗之談，對于不熟悉的蛋白，通常都要小心求證，尤其在開始階段；有條件的話，換個抗其他區段的同一蛋白的抗體或者其他來源（Rab、Gab、Mab）同一蛋白的抗體标記試試，兩種抗體能識别同一雜帶的概率還是很小的，尤其不同來源的，因為此時二抗也要相應更換，幾率更小。

WB結果白闆（無信号）和黑闆（高背景）。從抗體孵育角度解釋白闆和黑闆問題（當然也可能與ECL顯影有關，此點下一節有闡述），白闆主要是可能是抗體本身效價不高，或者抗體稀釋液中封閉蛋白過多，競争結合時封閉蛋白完全擠掉了特異性的一抗，特異性條帶和非特異性背景同樣結合強度--無信号。黑闆，也主要是因為抗體效價不高，而抗體稀釋液中封閉蛋白的拮抗作用又沒有完全發揮，此時無法有效識别抗原的一抗會等效的粘附轉印膜的任何位置，顯影後整張膜全黑。

有時候膜接近全黑，但可以若有如無的觀察到靶蛋白，出現問題的原因雖然仍是抗體效價不高，封閉蛋白不能完全起到作用，不過此時可以通過改變抗體稀釋液的配方，提高特異性和非特異性結合的信号差異，降低背景。

“這點非常重要”--當你的抗體标不到抗原時（白闆），先弄出條帶（黑闆），再解決黑闆（高背景）問題。第一步應該是通過倍比降低一抗的稀釋比（從1:1K降到1:500到1:250到。。。；注：二抗稀釋比不要輕易改變，增加二抗濃度對WB結果不會有太明顯的改變），摸索到一個可以标出信号的條件。此時，由于一抗濃度過高，背景可能非常高，但背景的問題可以再調整，有沒有特異性條帶卻沒辦法改變；實在沒有靶蛋白的信号，隻能更換别的公司生産的抗體。

文章來源：每日生物評論

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