一、實驗目的

ü 了解蛋白質的兩性解離性質

ü 學習測定蛋白質等電點的一種方法

ü 加深對蛋白質膠體溶液穩定因素的認識

ü 了解沉澱蛋白質的幾種方法及其實用意義

ü 了解蛋白質變性與沉澱的關系

二、實驗原理

v 蛋白質等電點測定

Ø 蛋白質是兩性電解質，在蛋白質溶液中存在下列平衡：

Ø 蛋白質分子的解離狀态和解離程度受溶液的酸堿度影響。當溶液的pH達到一定數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液的pH值稱為此種蛋白質的等電點（PI）。

Ø 不同蛋白質各有其特異的等電點，在等電點時，蛋白質的理化性質都有變化，可利用此種性質的變化測定各種蛋白質的等電點。我們測等電點最常用的方法是測其溶解度最低時的溶液pH值

Ø 本實驗借觀察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度以測定酪蛋白的等電點。用醋酸與醋酸鈉配制成各種不同pH值的緩沖液，向各緩沖液中加入酪蛋白後，沉澱出現最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點

v 蛋白質的沉澱與變性

Ø 在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因失去電荷和脫水而沉澱

Ø 蛋白質的沉澱可分為兩類：

（1）可逆的沉澱反應：蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化，除去引起沉澱的因素後，蛋白質的沉澱仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質而不變性。如大多數蛋白質的鹽析作用或低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質

（2）不可逆的沉澱反應：蛋白質分子内部結構發生重大改變，蛋白質常變性而沉澱，不再溶于原來溶劑中。如加熱引起的蛋白質沉澱與凝固，蛋白質與重金屬離子或某些有機酸的反應

ü 注意：蛋白質變性後，有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在（如電荷），并不析出，因此變性的蛋白質并不一定都表現為沉澱，而沉澱的蛋白質也未必都已變性

v 沉澱蛋白質的方法

Ø 鹽析法：向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽（如硫酸铵，硫酸鈉或氯化鈉），使蛋白質脫去水化層而聚集沉澱。鹽的濃度不同，析出的蛋白質也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸铵溶液中析出。鹽析沉澱一般不引起蛋白質變性，當除去鹽後，即可溶解

Ø 重金屬鹽沉澱法：當溶液pH大于蛋白質等電點時，蛋白質顆粒帶負電荷，容易與重金屬離子（Hg2 、Pb2 、Cu2 或Ag ）結合成不溶性鹽而沉澱。誤服重金屬鹽的病人可口服大量牛乳或豆漿等蛋白質進行解救就是因為它能和重金屬離子形成不溶性鹽，然後再用催吐劑排出體外。

Ø 某些有機酸沉澱法：某些有機酸指的是三氯乙酸、磺基水楊酸和硝酸等。當溶液pH小于等電點時，蛋白質顆粒帶正電荷，容易與酸類的酸根負離子發生反應生成不溶性鹽而沉澱。

Ø 有機溶劑沉澱法：向蛋白質溶液中加入一定量的極性有機溶劑（甲醇、乙醇或丙酮），因引起蛋白質脫去水化層以及降低介電常數，緻使蛋白質顆粒容易凝集而沉澱。此法如果控制在低溫下操作并且縮短處理時間，則可使變性速度減慢。

Ø 加熱變性沉澱法：幾乎所有的蛋白質都因加熱變性而凝固。少量鹽類促進蛋白質加熱凝固，當蛋白質處于等電點時，加熱變性凝固最完全和最迅速。加熱變性引起蛋白質凝固沉澱的原因可能是由于熱變性使蛋白質天然結構解體，疏水基外露，因而破壞了水化層，同時由于蛋白質處于等電點，也破壞了帶電狀态。古代人将大豆蛋白質的濃溶液加熱并點入大量鹽鹵（含MgCl2）制豆腐，便是此方法的成功應用。

三、實驗器材

溫度計，錐形瓶，恒溫水浴鍋，容量瓶，吸管，試管及試管架，乳缽

四、實驗材料與試劑

Ø 0.4％酪蛋白醋酸鈉溶液

Ø 1mol/L醋酸溶液

Ø 0.1mol/L醋酸溶液

Ø 0.01mol/L醋酸溶液

Ø 蛋白質溶液：5％卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液

Ø 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液

Ø 3％硝酸銀溶液

Ø 5％三氯乙酸溶液

Ø 95％乙醇

Ø 飽和硫酸铵溶液

Ø 硫酸铵結晶粉末

Ø 0.1mol/L鹽酸溶液

Ø 0.1mol/L氫氧化鈉溶液

Ø 0.05mol/L碳酸鈉溶液

Ø 甲基紅溶液

五、實驗操作

Ø 等電點的測定

§ 取同樣規格的4支試管，按下表順序分别精确地加入各試劑，然後混勻

§ 振蕩搖勻後，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管内加8mL水，然後在第2、3号管中各加1滴甲基紅，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顔色的變化和沉澱的生成

§ 每管再加0.1mol/L鹽酸溶液數滴，觀察沉澱是是否再溶解。解釋各管發生的全部現象

六、實驗思考

Ø 何謂蛋白質的等電點和沉澱反應？有何實用意義？

Ø 詳細記錄各實驗的結果和現象，并解釋這些現象。

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