器材和試劑

顯微鏡、接種環、酒精燈、載玻片、吸管、菌種、培養基、革蘭染色液、生理鹽水等。

原理：

1.革蘭陽性菌細胞壁結構較緻密，肽聚糖層厚，脂質含量少，乙醇不易透入；而革蘭陰性菌細胞壁結構較疏松，肽聚糖層少，脂質含量多，乙醇易滲入。

2.革蘭陽性菌的等電點低（pI2～3），革蘭陰性菌等電點較高（pI4～5），在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶陰電荷比革蘭陰性菌多，與帶正電荷的結晶紫染料結合較牢固且不易脫色。

3.革蘭陽性菌細胞内含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結晶紫和碘牢固地結合成大分子複合物，不易被乙醇脫色；而革蘭陰性菌細胞内含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成的複合物分子也較小，故易被乙醇脫色。

操作方法：

1．細菌塗片标本的制作

（1）塗片：取潔淨載玻片一張，用玻璃鉛筆于玻片上劃個直徑1.5cm左右的圓圈。用接種環在圓圈内各加1環生理鹽水。接種環滅菌後，挑取細菌少許在鹽水中磨勻，呈輕度混濁。塗好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。每次取菌前後注意将接種環滅菌。如果是液體培養物可直接塗抹于潔淨的載玻片上。

（2）幹燥：塗片最好在室溫下自然幹燥，或将标本面向上，置于酒精燈火焰高處慢慢烘幹，切不可在火焰上燒幹。

（3）固定：細菌的固定常用火焰加熱法，即将上述已幹的塗片在酒精燈火焰中通過3次。固定的目的在于殺死細菌，并使菌體與玻片粘附牢固，染色時不緻于被染液和水沖掉，同時固定可凝固細胞質，改變細菌對染料的通透性。

2.細菌塗片标本的染色

（1）初染：将結晶紫染液加于制好的塗片上，染色 1min，用細流水沖洗，甩去積水。

（2）媒染：加盧戈碘液作用1min，用細流水沖洗，甩去積水。

（3）脫色：滴加95%酒精數滴，搖動玻片數秒鐘，使均勻脫色，然後斜持玻片，再滴加酒精，直到流下的酒精無色為止（約0.5min），用細流水沖洗，甩去積水。

（4）複染：加稀釋石炭酸複紅染0.5min，用細流水沖洗，甩去積水。

待标本片自幹或用吸水紙吸幹後，在塗片上滴加香柏油，置油鏡下觀察。

結果判定：被染成紫色的細菌為革蘭陽性菌；被染成紅色的細菌為革蘭陰性菌。

影響因素：

1.操作因素：塗片太厚或太薄，固定時菌體過分受熱，以及脫色時間長短，都會影響染色結果。

2.染液因素：所有染液應防止染液蒸發而改變濃度，特别是盧戈碘液久存或受光作用後易失去媒染作用；塗片積水過多會改變染液濃度，影響染色效果，如脫色用的乙醇以95%為宜，濃度降低會增強其脫色能力。

3.細菌因素：細菌的菌齡不同，革蘭染色結果也有差異，一般以18～24h的培養物染色效果最好，菌齡過長影響細菌染色性。

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